GUIA DE HPLC

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Determinación de la concentración de  ácido ascórbico en jugos de fruta envasados.

Introducción

La vitamina C presenta dos formas activas: el ácido ascórbico (AA)  y  ácido dehidroascórbico (ADHA). Ambas son muy lábiles y sensibles a la oxidación. En los alimentos frescos el AA se oxida progresivamente a ADHA y finalmente puede perder su actividad biológica al transformarse en ácido dicetogulónico que carece de actividad vitamínica.

La determinación de vitamina C total se lleva a cabo utilizando un reductor, ditiotreitol (DTT) que reduce  el ADHA formado a AA.

Técnica

Se determina el contenido de vitamina C en jugos elaborados, mediante la técnica de Behrens y Madère modificada que consiste en una cromatografía  líquida de alta resolución en  fase reversa con detección uv a 254 nm. La cuantificacíon se realiza por el método del estandar externo.

Reactivos

• Buffer fosfatos pH 9.8

• Solución de ácido metafosfórico(HPO3)  al 17 %.

• Solución de HPO3 al 0.85 %. Se prepara por dilución de la solución de HPO3 17% p/v.

• Solución reductora. Preparar una solución  de ditiotreitol al 0.5 % en buffer fosfato pH 9.8

• FASE MOVIL. Solución de NaCH3COO.3H2O (95%) / metanol (5%).

      Pesar 10.8816 g de acetato de sodio, llevar a un litro de agua con H2O bidestilada.

      Agregar   0.1725 g de HPO3 y 50 ml de CH3OH grado HPLC. Ajustar el pH a 4.6 con KOH o

      AcH.

• Solución para la dilución final de las muestras. Pesar 10.8816 g de NaCH3COO.3H2O  , disolver y llevar a 1 l con agua bidestilada. Agregar 150 ml de CH3OH. PH final 4.8.

• Ácido ascórbico (estandar). Pesar en balanza analítica 0.3 gramos de ácido ascórbico eliminar la humedad en estufa de vacío a 100 º por 1 hora. Enfriar y pesar para obtener la masa del producto seco.

Precauciones

Todas las soluciones deben ser conservadas en heladera para evitar el desarrollo de microorganismos.

Se debe filtrar la fase móvil para eliminar partículas en suspensión.

Dada la inestabilidad  del ácido ascórbico en solución acuosa, tanto las muestras como estándares deben mantenerse a bajas temperaturas (baño de hielo), protegidos de la luz directa (matraces color caramelo o envueltos en papel de aluminio) y en ausencia de oxígeno.

Técnica analítica

• Preparación de las muestras

Pesar en balanza analítica 1 g de muestra de jugo. Agregar PO3H 0,85% hasta un volumen final de 10,00 ml y homogeneizar.

Centrifugar a 4000 rpm durante 30 minutos entre 2 y 4 ºC.

En dos matraces de 10 ml colocar 4 ml del sobrenadante. En uno de ellos se determinará  AA + ADHA, para ello se deben agregar 1.15 ml de solución reductora de DTT e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido el período de incubación  enrasar con solución de HPO3 al 0.85%; tomar una alícuota de 0.50 ml y diluir con solución  buffer pH 4.8.Filtrar e inyectar de inmediato.

En el otro matraz se determinará sólo AA para ello se deberá agregar 1.15 ml buffer fosfatos  pH 9.8, enrasar inmediatamente con solución de HPO3 al 0.85%, tomar 0.50 ml y diluir hasta 10,00 ml con buffer 4.8. Filtrar e inyectar de inmediato.

• Curva de calibración

Disolver los 0.3 g de  ácido ascórbico, previamente secados y pesados,  en 50,00 ml de solución de HPO3 0.85 %. Hacer una dilución 1/20 tomando 0.5 ml de solución estandar y solución de HPO3 0.85 % hasta un volumen final de 10,00 ml.

Sobre una alícuota de 4.00 ml  agregar 1.15 ml de solución reductora de DDT e incubar  30 minutos a temperatura ambiente. Enrasar hasta 10.00 ml con solución de HPO3 al 0.85 %.

De esta solución se realizan las diluciones para la curva patrón tomando 0.625 ml y llevando a 50.00 ml con buffer pH 4.8 y 0.25 ml y 0.50 ml enrasando en 10.00 ml con la misma solución.

Las concentraciones finales obtenidas serán respectivamente 150, 300 y 600 μg %, con pequeñas variaciones de acuerdo a las diferencias en la pesada(QUE DEBEN SER CALCULADAS).

• Determinación Cromatográfica

HPLC

Equipo HPLC Konik KNK 500 con integrador Spectra Phisics SP4600.

Volumen de inyección 100 μL (volumen efectivo 20 μL )

Sistema de desgasificación de solventes con gas helio

Detector ultravioleta (lecturas a 254nm)

Columna: C18

Flujo: 1 ml/min

Fase móvil:  buffer AcNa 80 mmolar- 15% MeOH - 0,015% HPO3.

Temperatura: ambiente

Filtros

Todas las muestras son filtradas previo a la introducción al sistema, de esta manera se eliminan pequeñas partículas o cristales que con el tiempo podrían obstruir el sistema.

Se utilizan filtros de jeringa con membrana de nylon de 0.45 micrones de tamaño de poro.

Jeringa de injección de 100 μL marca Hamilton.

Manejo del equipo

Encender el equipo, el detector y el integrador.

Desgacificar la fase móvil con gas helio.

Seleccionar la longitud de onda de trabajo en el detector. Una vez estabilizado el mismo llevar a 0 de absorbancia.

Purgar el equipo para eliminar posibles burbujas en el sistema por aproximadamente 5 minutos.

Introducir la jeringa, que contiene la muestra previamente filtrada, en el canal de la válvula de inyección, la misma debe encontrarse en posición de carga (load). Una vez descargada la muestra en la válvula llevar la posición de la misma a injet. Al mismo tiempo accionar el integrador para que registre el cromatograma.

Previamente se programará el registrador para que integre las señales comprendidas bajo el pico del cromatograma señalado como ácido ascórbico.  Luego se relacionará el área obtenida con la concentración respectiva de los estándares.

Finalmente, al registrar el cromatograma de cada muestra, se realiza la cuantificación de  la misma por comparación de las áreas obtenidas con las de los estándares.

Hacer 3 cromatogramas por muestra y promediar los resultados.

Cálculos

En alícuota a la que se adicionó buffer fosfatos se calcula  AA en mg/ 100 g de alimento.

En la alícuota  que se agrega  ditiotreitol (DTT) se calcula vitamina C (AA + ADHA) en mg/100g de alimento.

El ADHA se calcula por diferencia.  

CUESTIONARIO Y PROBLEMAS

1. Comportamiento cromatográfico de solutos.Defina:  tiempo de retención, volumen de retención, resolución, coeficiente de reparto, retención relativa

1. Tipos de cromatografía líquida. De acuerdo a la naturaleza de las interacciones soluto-fase estacionaria-fase móvil, se pueden clasificar como: Cromatografía en fase normal, cromatografía en fase reversa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración o exclusión molecular.

Explique  los fundamentos de cada tipo de cromatografía. Indique las estructuras típicas de las fases estacionarias  utilizadas en cada una. Mencione como se clasifican las fases móviles para cada caso según fuerza de solvente o series eluotrópicas.

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