Informe Corregido 2

INTRODUCCIÓN

Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente (como un láser), las ondas están en fase, o sea, los picos y los valles de las ondas coinciden. Esto tiene el efecto de reforzar las ondas y crear una mayor amplitud, que percibimos como un aumento en el brillo. Sin embargo, cuando las ondas de luz están fuera de la fase, se interfieren entre sí reduciendo la amplitud y el brillo.

Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se difractan y sus trayectorias cambian ligeramente. Esta difracción altera las relaciones de la fase de las ondas, dando como resultado cantidades variables de interferencia. La cantidad de interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una célula no es grande, y el contraste que se detecta es escaso cuando la célula se observa con un microscopio óptico común, lo cual por su puesto es la razón por la cual las células deben teñirse. Sin embargo, en los microscopios de contraste de fase y de interferencia diferencial, sistemas ópticos especialmente diseñados intensifican la escasa interferencia y proporcionan un mayor contraste. La resolución de estos microscopios es limitada, como ocurre en un microscopio óptico común, pero suministran una perspectiva diferente de la célula viva, mostrando aspectos difíciles de detectar en otro sistema.

Otra técnica usada frecuentemente en las células vivas es la microscopia de campo oscuro. El haz de iluminación llega a la muestra desde el costado y los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por el espécimen, que aparece como un objeto brillante contra un fondo oscuro. Los rasgos de las células que son visibles en estas fotomicrografías, a menudo adquieren un gran relieve en las de campo oscuro.

Actualmente, ocurre un rápido progreso en el uso de otras técnicas microscópicas; por ejemplo, acoplando cámaras de televisión a los microscopios ópticos es posible efectuar las observaciones en la pantalla y grabarlas en una cinta de video. Ajustando los controles, como puede hacerse en un aparato de televisión, el “ruido” de fondo puede reducirse, mejorar el contraste e intensificar aspectos particulares. Las técnicas de televisión aplicadas al estudio de la célula viva están en su infancia, pero están generando gran excitación, dado que revelan procesos no vistos previamente dentro de la célula.

Los constantes avances en la microscopía han permitido su utilización en muchos aspectos de la biología celular, fisiología e incluso en patología humana, uno de éstos es la determinación del número de células en suspensión. Por ejemplo, en hematología humana no tan sólo es importante conocer el tipo y características de las células presentes en la sangre, sino que además el número de cada una de ellas presentes en un volumen determinado (por ej.: 1 ml o 1 mm3).

Objetivo del práctico:

En este laboratorio el objetivo principal es que el estudiante observe preparaciones frescas de sangre generando un campo oscuro; conozca la técnica de recuento de glóbulos rojos a través de la cámara de Neubauer y determine el tamaño celular en un frotis sanguíneo permanente.

Recuento de células en cámara de Neubauer:

Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio.

La placa base en vidrio óptico especial tiene el tamaño de un portaobjetos (Fig.1 A). Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores y 3 campos pequeños interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se utilizan para rotulación, los campos interiores están esmerilados y pulidos (Fig.1 B). En el campo central (= fondo cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento separadas una de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0,1 mm más bajo (= profundidad cámara) que ambos campos adyacentes. Entre campo central y cubreobjetos ya colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitación lateral del volumen a contar se forma mediante las superficies imaginadas por la proyección vertical sobre las líneas exteriores de la cuadrícula de recuento.

Procedimiento para utilizar la cámara: Se coloca un cubreobjeto sobre una cámara Neubauer limpia y seca, y se deposita una gota en uno de los lados del cubreobjeto; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retículo de la misma.

Una vez preparada se espera un poco para que sedimenten las células en reposo, y luego se procede a colocar la cámara sobre la platina del microscopio (no colocar antes, pues el calor de la fuente de luz comienza a evaporar el líquido).

Fig. 1: Procedimientos en la utilización de una cámara de Neubauer.

Como determinar el número de células con cámara de Neubauer usando el cuadrado central: Recuento de glóbulos rojos.

El cuadrado central posee 25 cuadrados grandes (cada uno subdivido en 16 cuadrados menores) (Fig1 C). Si cada uno de los cuadrados grandes posee 1/5 mm de lado, la superficie de 1 cuadrado grande será:

= 1/5 1/5 = 1/252

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

= 1/252 1/10 = 1/2503

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados, el número de glóbulos por cuadrado será “a / n”, y si en un cuadrado de volumen 1/250 mm3 hay “a / n” glóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X.

= 250/

Siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.

Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200, respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).

= 250/ = /3

Fig. 2: Área de recuento de células rojas.

Para tener en cuenta:

1. Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes, debido a que los eritrocitos se encuentran en mayor cantidad.

2.

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