Ingieneria De Alimentos

PRÁCTICA N° 3

ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL PESCADO

Introducción

La denominación “pescado” se utiliza como nombre específico de los peces que nadan libremente, y como nombre genérico que incluye a todos los pescados comestibles de agua dulce y marina. La musculatura comestible de los pescados es rica en proteínas y pobre en carbohidratos. Las variaciones en la composición química están estrechamente relacionadas con la alimentación, nado migratorio y cambios sexuales relacionados con el desove. El pez tiene períodos de inanición por razones naturales o fisiológicas (como desove o migración), o bien por factores externos como la escasez de alimento. Esto influye en la textura, sabor y posiblemente en la alteración microbiana.

La carne de pescado es un excelente sustrato para el crecimiento de la mayoría de las bacterias heterótrofas y su composición influye sobre el desarrollo y actividades bioquímicas. El contenido en carbohidratos de los pescados y crustáceos es despreciable, lo que hace que la caída del pH asociada a la producción de ácido láctico durante el rigor mortis sea limitada. Los moluscos contienen 2-5% de glucógeno, permitiendo así una caída del pH a medida que los carbohidratos son metabolizados por el tejido muscular. El tejido muscular del pescado contiene concentraciones altas de compuestos de nitrógeno no proteico que facilitan el desarrollo de las bacterias. Posee oxido de trimetilamina que es reducido por las bacterias alterantes a trimetilamina, responsable del característico olor a pescado descompuesto. Los aminoácidos libres influyen en el modelo de alteración.

Los pescados y mariscos se capturan en aguas profundas y alejadas de la costa, y en aguas poco profundas adyacentes a la línea costera. Los estuarios en donde las aguas marinas y dulces coinciden son generalmente ricas en zonas de pesca, que pueden estar bacteriológicamente contaminadas a partir de fuentes humanas. La pesca también se realiza en ríos y lagos cuyas aguas van de límpidas y transparentes a contaminadas. En consecuencia, el nivel de contaminación del pescado vivo con bacterias de interés en salud pública varía mucho con la localización.

Desde su producción hasta su consumo, los pescados y mariscos transitan por una serie de etapas en las cuales existe la posibilidad de que accedan diferentes microorganismos a la matriz alimenticia. La calidad y cantidad de los mismos definen las modificaciones que tienen lugar en el producto y sobre todo las consecuencias de su consumo por parte del hombre. Estas modificaciones pueden ir desde cambios inofensivos en las características organolépticas del alimento, hasta consecuencias graves causadas por las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA).

Por esto es necesario contar con métodos que permitan establecer límites de aceptabilidad de los productos y con ellos todas las técnicas que permitan evaluar de forma representativa los grandes volúmenes comercializados. Los métodos creados con este fin se denominan criterios microbiológicos.

Microflora Inicial

La carga microbiana de los peces vivos es un reflejo de la microflora de su entorno en el momento de su pesca o captura pero se modifica de acuerdo con la capacidad de los distintos microorganismos de multiplicarse en los subambientes que constituyen las superficies de la piel, las agallas y el tracto digestivo.

El tejido muscular y los órganos internos de los peces y mariscos sanos recién capturados son normalmente estériles, pero suelen encontrarse bacterias en la piel, caparazón quitinoso y agallas, así como en el tracto intestinal. El sistema circulatorio de algunos crustáceos no es cerrado, como la hemolinfa de los cangrejos, y puede albergar concentraciones elevadas de bacterias, especialmente del género Vibrio.

Objetivos

• Determinar la flora microbiana presente en el pescado.

• Aplicar los métodos de recuento, aislamiento y NMP para la determinación de la presencia de microorganismos en las muestras de pescado según lo dictamine la norma COVENIN.

Materiales y Equipos

- Muestras problema - Rastrillo de vidrio

- Placas de Petri estériles - Mechero

- Asa de platino - Caldo lactosa bilis verde brillante

- Tubos con agua peptonada - Caldo lauril sulfato triptosa

- Hipoclorito de sodio 10% - Papel absorbente estéril

- Agua destilada estéril - Agar infusión cerebro corazón

- Lupa o cuenta colonia digital - Agar Braird-Parker

- Tubos de ensayo - Agar nutritivo

- Tubos de Durham - Marcador indeleble

- Pinzas - Algodón y Alcohol

- Caldo lactosa - Pipetas de vidrio de 1; 5 y 10 mL

Análisis microbiológicos

• Numeración de bacterias aerobias mesófilas

• Numeración de coliformes por NMP

• Aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus

• Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae

Para realizar los analisis microbiologicos de las muestra de pescado se usan filetes de pescado, descamados y sin espinas.

Numeración de bacterias aerobias mesófilas.

1. Preparación de Diluciones.

a) Homogenizar la muestra y mezclar 25 veces en un ángulo de 45º.

b) Pesar o medir 10 g o 10 mL de la muestra y transferir a un frasco de dilución con 90 mL de agua peptonada al 0,%, agitar 25 veces (1era dilución 10-1)

c) A partir de la primera dilución, repetir el procedimiento del paso 2 hasta obtener 5 diluciones.

d) Utilizar una pipeta diferente para cada dilución.

e) La siembra debe realizarse durante los 20 min. Siguientes de la preparación de las diluciones.

Una vez preparadas las diluciones se realiza el contaje en placa (método estándar)

2. Siembra en profundidad:

a) Preparar dos placas de Petri estériles para cada dilución, y marcarlas con la dilución correspondiente, nombre de la muestra, fecha y cualquier otro dato adicional necesario.

b) Medir 1 mL de cada dilución, por duplicado empleando una pipeta por dilución y depositar cada ml en el fondo de las placas de Petri.

c) Añadir en cada placa de 12 a 15 mL, del agar nutritivo, el cual debe fundirse previamente y enfriarse hasta una temperatura de 44- 46 °C.

d) Mezclar inmediatamente las diluciones con el Agar, haciendo un movimiento de rotación en las placas, 5 veces a la derecha, 5 veces a la izquierda, seguido de un movimiento de vaivén realizando 5 veces desde arriba hacia abajo y 5 veces de derecha a izquierda. Dejar solidificar el agar.

e) Incubar las placas por el tiempo especificado (24 o 48h ± 2)

f) Cuente las colonias y repórtelas en UFC por g de pescado

Determinación de coliformes totales y fecales por NMP (COVENIN 1104:96).

La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa. Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo “es una presunción”, que habrá de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica.

Prueba Presuntiva

a) Preparar tres diluciones sucesivas (10x, 10y y 10z) de 3 tubos con caldo lactosado.

b) Etiquetar las diluciones 10x, 10y y 10z.

c) Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar.

d) Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación.

e) Inocular con una pipeta, un (1) ml de muestra en la serie de tubos con caldo lactosado. La misma pipeta se puede utilizar para inocular todos los caldos siempre y cuando se siembren las diluciones más altas y luego las más bajas.

f) Normalmente, siempre que no se sospeche que la carne contenga elevada carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos.

g) Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48 horas

h) Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de gas en la campana Durham.

i) De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.

j) En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más.

k) Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.

l) Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se toman como negativos.

Interpretación de los resultados.

Si el total de tubos están Negativos el examen se da por terminado, reportando ausencia de coliformes totales y fecales en la muestra analizada. Todos aquellos tubos que den Positivos para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se procederá a realizar la prueba confirmatoria para Coliformes Totales y Fecales.

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