Inmovilizacion de enzimas

OBJETIVOS

• Inmovilizar células de Saccharomyces cerevisiae por atrapamiento en gel de alginato de sodio

• Producir invertasa a partir de las células inmovilizadas en la matriz polimérica

• Evaluar la actividad enzimática de la invertasa producida por la inmovilización

MARCO TEORICO

En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica.

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:

Presentan una gran actividad catalítica;

Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.

A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar.

Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente (1). Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (2).

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (3):

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.

3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen en la Figura 1. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son (4):

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.

2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones

de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.

3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.

4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías:

1Retención física

2) Unión química

REACTIVOS:

• solución isotónica NaCl 0.85%

• sacarosa al 10 % p/v

• Glucosa oxidada

• Alginato de sodio

• Agua destilada

• Reactivo DNS

MATERIALES:

• 6 tubos de ensayo

• 4 pipetas 1, 2.1, 5 ml

• Espátula

• 2 Beakers de 250 ml

• 2 Pipetas Pasteur

• Gasa estéril

• Espectrofotómetro-celdas

• Plancha de calentamiento

• Centrifuga

PROCEDIMIENTO:

Inmovilización ionotrofica en alginato de calcio

• Tomar 14 ml de medio de cultivo

• Centrifugar 7 ml de medio de cultivo por 30 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con el mismo volumen de solución isotónica.

• A 7 ml de medio de cultivo adicione 0.5g de alginato de sodio, mezclar

• Tomar 50 ml de cloruro de calcio en un vaso precipitado de 250 ml

• Adicionar al mismo tiempo por goteo las dos soluciones preparas anteriormente y observar la formación de cristales

• Separar las perlas de cloruro de calcio mediante un proceso de filtración

Verificar la producción de enzimas

En un Erlenmeyer de 150 ml agregue 30 ml de sacarosa, junto con las perlas formadas, llevar a un shaker a 150 rpm y 30°c por 30 minutos. Hacer la prueba de glucosa DNS ( tomar 0.5 ml de la solución anterior, agregar 3 ml de DNS, mezclar, hervir por 10 minutos, agregue 5 ml de agua destilada, leer la absorbancia a 540 nm )

Diluciones para la curva de calibración de azucares reductores

Preparar las siguientes muestras según la tabla:

N° TUBO VOLUMEN PATRON GLUCOSA (ML) VOLUMEN AGUA DESTILADA (ML)

B 0 0.5

1 0.1 0.4

2 0.2 0.3

3 0.3 0.2

4 0.4 0.1

5 0.5 0

• Colocar las soluciones anteriormente preparadas a agua hirviendo durante 10 minutos

• Trasferir inmediatamente a un baño de agua-hielo por 2minutos

• Adicionar a cada tubo de ensayo 5 ml de agua destilada, agitar

• Leer la absorbancia la muestra en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm

RESULTADOS

DATOS OBTENIDOS:

N° TUBO A

B 0

1 0.702

2 0.742

3 0.930

4 1.038

5 1.709

• TUBO MUESTRA: 0.632

CURVA DE CALIBRACION

ANALISIS DE RESULTADOS

 Según lo analizado por los métodos de inmovilización de enzimas los procesos de glucosa/ oxidasa o por el de DNS, los dos tienes factores a favor y en contra para la realización de estos procesos sin embargo en el proceso de glucosa/ oxidasa se utilizan microorganismos que puedan degradar el oxígeno, un factor importante que se tiene con este microorganismo es el rango tan amplio que maneja para la inmovilización de enzimas.

 Este proceso si se ve conveniente para la producción de enzimas ya que con estos procesos se ha podido crear un forma más estable de la enzima sin que esta pierda las características que se le atribuyen, en donde una de las más importantes es la reutilización que estas pueden tener, sin embargo este proceso no es 100 % confiable ya que cuenta con algunos inconvenientes como pueden ser: Que en el proceso de inmovilización la enzima siempre va a perder una parte de las características que se le atribuyen, ya que por esto cada vez que se reutilicen van a tener menos características deseadas.

PREGUNTAS ORIENTADORAS:

1) Que otro método se puede aplicar a la practica

1. Atrapamiento

Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.

2. Microencapsulación:

En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos.

3. Reactores de membrana:

El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente

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