LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO[pic 1]

UNIDAD ACADEMICA FACULTAD DE MEDICINA

LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO  MOLECULAR

Extracción de DNA de células mononucleares

1. Adicionar 3 ml de sangre periférica (con EDTA) en un tubo Falcón estéril y agregar la misma cantidad de TTS.
2. Homogenizar la mezcla y centrifugar a 3500 rpm/30min.
3. Decantar el sobrenadante en un recipiente con cloro al 10% quedando solo un pellet de células. OJO NO PERDER EL PELLET CELULAR
4. Agregar al tubo 1 ml de TTS, liberar el pellet y transferirlo a un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril. Homogenizar en el vortex  hasta su disolución completa.
5. Centrifugar 5 minutos a 12000 rpm.
6. Decantar el tubo eppendorf y adicionar nuevamente 1 ml de TTS, centrifugar y decantar nuevamente.
7. Repetir los pasos 6, 7 y 8 hasta que el pellet quede completamente blanco.
8. Agregar al tubo eppendorf 570 µl de NaCl al 5 mM.
9. Homogenizar en el vortex, hasta la disolución del  pellet (2 min. Aprox)
10. Adicionar 30 µl de SDS al 10%. Y homogenizar manualmente (5 min. aprox)
11. Agregar 200 µl NaCl saturado. Homogenizar en el vortex, hasta la disolución del  pellet (2 min. Aprox)
12. Centrifugar a 11500 rpm a 4°C durante 30 min.
13. Transferir el sobrenadante en un tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo (esteril) y agregar 500 µl de etanol absoluto frío.
14. Dejar precipitar toda la noche a -20°C.
15. Centrifugar a 12000 rpm a 4°C durante 10 min.
16. Decantar el sobrenadante en un recipiente con cloro al 10%.
17. Lavar 3 veces el DNA con 1 ml de etanol al 70% y centrifugar a 12000 rpm a 4°C durante 10 min.
18. Decantar el sobrenadante, quedando solo un pellet viscoso.
19. Colocar el tubo boca abajo sobre gasas estériles para que se evapore el etanol.
20. Una vez seco el tubo se adicionan 150 µl de agua inyectable y disolver el DNA.
21. Para determinar su concentración y pureza se hace una dilución 1:99
22. Conservar el DNA a -20°C.

PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA

UltraPureTM Agarose

invitrogenTM

[pic 2]

TBE                                       GEL DE AGAROSA 1.5%

50 ml   -----------------------------------------------    0.75 g

30 ml   -----------------------------------------------    0.45 g

MATERIALES:

1. Papel aluminio
2. Balanza análitica
3. Plato térmico
4. Matraz Erlenmeyer
5. Micropipetas
6. Soporte
7. Cámara de electroforesis horizontal
8. Peine para el soporte
9. Guantes de latex

REACTIVOS:

1. Bromuro de etidio
2. Gel de agarosa al 1.5%
3. TBE 1X

PROCEDIMIENTO:

1. Pesar 0.45 g de gel de agarosa al 1.5% en la balanza analítica.
2. Colocar el soluto en el matraz y verter 30 ml de TBE 1X
3. Colocar el matraz sobre el plato térmico hasta ebullición hasta su completa disolución.
4. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregar .5 μl de bromuro de etidio.
5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución.
6. Sirva la solución lentamente en el soporte previamente sellado con cinta (sin dejar burbujas).
7. Colocar el peine en el soporte y dejar gelificar la agarosa.
8. Ya gelificada la agarosa retirar las cintas de sellado del soporte y colocarlo en la cámara de electroforesis.
9. Llenar la cámara de electroforesis con buffer TBE 1x hasta cubrir el gel.
10. Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradué el voltaje deseado t corra las muestras.

Voltaje 120

mA 150

min 30

CARRILES:

8 micro de muestra y 2 micro de buffer

Carril 1

Carril 2

Carril 3

Carril 4

Carril 5

Carril 6

Cuantificación de ADN

En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, So bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 μg/mL de ADN doble hebra,40 μg/mL de ARN o 33 μg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra. En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos.

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