La tuberculosis

Ha habido un resurgimiento en las enfermedades resultantes de infecciones con microbacterias en los últimos 25 años. La tuberculosis se está convirtiendo en un importante problema de salud en el pensamiento, debido a la virulencia de los organismos en gran medida. Los constituyentes más externos de los bacilos, que incluyen el material extracelular liberado por microbacteria de crecimiento activo en medios de cultivo artificiales, están compuestos por principalmente de proteínas y carbohidratos. Durante los últimos años, ha habido un significativo cambio en nuestro conocimiento sobre las tácticas utilizadas por los microorganismos patógenos para infectar a sus hospedadores. 

Muchas de estas proteínas, por ejemplo las proteinasas bacterianas, tienen suficiente actividad enzimática para explicar su toxicidad. En el caso de Micobacterias, la presencia de actividades enzimáticas en cultivos de M. tuberculosis ha sido conocida por un largo tiempo hora. Culturas, en general para identificar las especies. En ambos casos, sin embargo, y debido a la extensa autolisis que ocurre en cultivos de micobacterias, la Cuestión de la localización exacta de estas actividades. 

Material liberado de M. tuberculosis durante su Las diferentes fases de crecimiento han sido reinvertidas por varios autores Estos estudios establecieron firmemente que la Cultivos filtrados de la fase de crecimiento inicial, en la que La lisis bacteriana fue mínima, contenida secretada. Proteínas que También puede definirse por medios cuantitativos. Aunque numerosos estudios se han dedicado a Las propiedades antigénicas de estos polipéptidos secretados. Se rompieron utilizando una celda de presión francesa a 24000-26000 p.s.i. y las células rotas se centrifugaron durante 15 minutos a 3000 g. 

La mezcla se re suspendió en 20 ml de PBS frío y se centrifugó durante 30 minutos, a 3000g para eliminar las celdas intactas. Los 3000 g de sobrenadantes obtenidos de todas las especies de micobacterias examinadas, que consistían en citosol y envolturas celulares, se volvieron a centrifugar durante 20 minutos a 20000 g. Para prevenir cualquier contaminación bacteriana durante los experimentos de incubación, se agregaron sistemáticamente a los ensayos cloranfenicol y gentamicina a una concentración de 100 g / ml-l. La prueba API ZYM se usó para detectar la presencia de 19 actividades enzimáticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 

Se analizó la actividad de alanina aminopeptidasa utilizando 1 mM de L-alanina-p-nitroanilida en 25 mM Tris / Tampón HCl, pH 7.2. El índice de localización de una enzima dada se adaptó del propuesto anteriormente por Wiker et al. Para antígenos micobacterianos y se definió como la actividad extracelular total por mg de proteína del fluido de cultivo dividida por la actividad total por mg de proteína en el compartimento unido a las células. Se detectó mucinasa e hialuronidasa en una De manera similar,utilizando 0,28% de mucina estomacal porcina y 0,1% de ácido hialurónico de Streptococcus xooepidemicus , respectivamente, las reacciones se revelaron inundando las placas con cetrimida . 

La ADNasa y la ARNasa se ensayaron según lo descrito por Kannan et al. Además, las actividades de la endopeptidasa se analizaron en condiciones líquidas con sustratos cromogénicos 2 '/ o, Azocasein, Elastin-Congo Red, colágeno impregnado con Azo-tinte o Hide Powder Azure , tampón Tris / HCl 25 mM , pH 7.2. Las pruebas de rutina utilizadas en microbiología para detectar las actividades enzimáticas de los cultivos de agar o caldo se adaptaron a medios líquidos para los ensayos de las fracciones micobacterianas. La hidrolización de nitrocefina reveló urelina, hidrolasa de arginina, lisina descarboxilasa,ornitina descarboxilasa y fenilalanina desaminasa . 

Resultados

Crecimiento de M. smegmatis y secreción de proteínas es bien sabido que las microbacterias liberan diversas sustancias, incluidas las proteínas, en su medio circundante. Sin embargo, dependiendo del estado fisiológico de los cultivos, el material puede contener productos que se originan en la envoltura celular y / o en el compartimento citosólico de la célula. Los bacilos se multiplicaron por 3-4 d, seguido de una fase estacionaria. La actividad hidrolasa de Tween 80 apareció en el filtrado de cultivo desde el día 3, mientras que no se detectó actividad de isocitrato deshidrogenasa en el fluido de cultivo. 

La actividad de la alanina aminopeptidasa asociada a la célula se detectó en el fluido de cultivo desde el inicio de la fase estacionaria, es decir, el día 6, un resultado consistente con la observación previa de que una actividad máxima de esta enzima, que presumiblemente está involucrada en el recambio de la pared celular, ocurrió en la última fase de crecimiento exponencial de M. smegmatis. Esto explicaría la liberación de materiales solubles de la envoltura celular al fluido de cultivo. Por lo tanto, se consideró que las actividades enzimáticas presentes en el filtrado de cultivo de M. tu6erculosis H37Rv en el día 16 se derivan de una ubicación extracelular, mientras que las que aparecieron en cultivos más antiguos son probablemente Haber derivado de la autolisis de las bacterias. Actividad enzimática extracelular de M. smegmatis y M. tuberculosis Para determinar el perfil enzimático de las dos especies de micobacterias, primero realizamos un análisis cualitativo de los perfiles enzimáticos de los materiales extracelulares. 

"Los resultados preliminares demostraron que algunas de las actividades enzimáticas, especialmente las detectadas por las pruebas realizadas en placas de agar y en general todas las pruebas enzimáticas realizadas incubando los fluidos de cultivo más de 16 h a 37 "C, pueden dar resultados positivos falsos, probablemente debido contaminación con especies no micobacterianas. La fracción más susceptible a la contaminación bacteriana fue el fluido de cultivo dializado, probablemente debido a la eliminación del glicerol, que se sabe que es tóxico para muchas especies bacterianas en altas concentraciones. Curiosamente, sin embargo, diez de las actividades extracelulares de M. tuberculosis, aunque presentes en el extracto celular de M. smegmatis, no se detectaron en el filtrado de cultivo 5 d de M. smegmatis, lo que sugiere que tienen ya sea una ubicación asociada a la envoltura o citosólica en esta última especie. A la inversa, se detectaron dos actividades enzimáticas presentes en los extractos celulares de ambas especies en el fluido de cultivo de M. smegmatis pero no en el de M. tuberculosis. 

Debido a la gran diversidad de proteínas extracelulares producidas por las dos especies, no se pudo establecer una relación firme entre la presencia o la ausencia de una banda particular en la SDS-PAGE y las masas moleculares publicadas de los polipéptidos antigénicos secretados. El uso de los anticuerpos monoclonales disponibles dirigidos contra las enzimas purificadas confirmaron la presencia de alanina deshidrogenasa de 40 kDa en el filtrado de cultivo de M. tuberculosis H37Rv , pero este enfoque proporciona poca información sobre la actividad enzimática. Los intentos de revelar las actividades en geles se vieron obstaculizados por la desnaturalización irreversible de las enzimas en SDS-PAGE y la gran dificultad de adaptar la mayoría de las pruebas utilizadas para la detección de gel, en particular las basadas en la medición cinética de los sustratos. En consecuencia, las diez actividades enzimáticas presentes en el fluido de cultivo del bacilo tuberculoso y ausentes de las de la especie saprófita M. srnegmatis se cuantificaron utilizando métodos convencionales. 

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