Tuberculosis

La tuberculosis conocida como TB es una enfermedad infecto-contagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis conocido como Mtb, que afecta principalmente a los pulmones, aunque se puede alojar en locaciones extra pulmonares ya que con la concentración de CO2 ayuda en sí al crecimiento de esta enfermedad la pueden tener niños y adultos

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó una incidencia de 10,4 millones. en la cual aproximadamente el 10% de dichos casos representan coinfección esto quiere decir que es una infección simultánea por parte de dos o más patógenos por lo general con la tuberculosis es muy probable que se una con el VIH 

Como diagnóstico laboratorial de la tuberculosis antes casi siempre era por Bacterioscopía con coloración de Ziehl-Neelsen sin embargo era rápida pero con baja sensibilidad y sin diferenciación de especies OTRO tipo de ensayo era la de cultivos en medios sólidos convencionales presentaban mayor sensibilidad pero se demoraba mucho el crecimiento así que con la llegada de métodos automatizados la cantidad de pruebas aumentó y se redujo el tiempo de detección así que en el 2010, la OMS recomendó por vez primera la utilización de una prueba molecular que en 2 horas detecta de manera simultánea a Mycobacterium tuberculosis y la resistencia de la rifampicina la cual era una antibiótico, el nombre de esta prueba es Xpert MTB/RIF y se basa más o menos en amplificación de ácidos nucleicos 

La diferenciación de Mycobacterium tuberculosis por huellas genéticas nos ha permitido tener información sobre la epidemiología, genotipificación, reactivación, transmisión e incluso la reinfección exógena de esta enfermedad y con Las técnicas moleculares de análisis bioinformático permite ver la presencia de clados o ramas del árbol filogenético en la cual se agrupa a los seres vivos y esto ayuda a revelar brotes en la comunidad ya que el reconocimiento de sub-poblaciones o clones específicos con características genéticas o clínicas particulares podrían mejorar nuestro entendimiento acerca de las ventajas adaptativas de algunos linajes y de funciones de genes específicos en la patogenicidad, ayudando a crear nuevas estrategias para combatir a la Tuberculosis.

con respecto a este paper exactamente se usó La técnica molecular de MIRU-VNTR la cual consiste en la genotipificación basada en números variables de repeticiones en tándem (VNTRs) de diferentes clases de elementos genéticos intercalados llamados unidades repetitivas intercaladas micobacterianas (MIRUs) 

En un estudio de 1997 se reveló inicialmente que 12 de los 41 loci MIRU el genoma de Mycobacterium tuberculosis corresponden a regiones VNTR tipo minisatélites del genoma humano, bueno un loci es una posición fija en un cromosoma, que determina la posición de un gen o de un marcador presente Estos 12 loci contienen un número variable de copias de 51 a 77 (pb) y su variaciones en ellos virtualmente siempre consisten en la adición o deleción secuencial de unidades de tamaños idénticos

EN ESTE TRABAJO SE BUSCO LA genotipificación y epidemiología de tuberculosis dependiendo de la amplificación por PCR de varios loci con cebadores específicos para las regiones flanqueantes de cada locus repetido y en los tamaños de amplicones que reflejan el número de copias MIRU-VNTR en cada loci esto es interesante ya que a futuro podrían ser analizados por metodologías más complejas como Secuenciación de Genoma Completo

y como dato adicional Actualmente, la combinación de MIRU-VNTR con spoligotyping La cual es una tipificación con oligonucleótidos espaciadores basada tambien en PCR y algún otro método como los SNPs por ejemplo es actualmente el gold standard para la tipificación de aislados de Mtb a nivel global (Vasconcellos et al., 2014).. 

Se utilizó un total de 19 muestras, colocados en tubos tapa rosca con tampón Tris-EDTA 1X e inactivados por calor, conservados hasta la fecha a -20 °C. En el IICS se realizó la extracción y purificación del ADN utilizando el método CTAB (van Soolingen, de Haas, Hermans y van Embden, 1994). Las muestras excluidas componen aislados cuya cuantificación de ADN fue insuficiente y/o poseían ADN degradado.

Tipificación por MIRU-VNTR 12 

La amplificación de los 12 loci MIRU-VNTR fue ejecutada utilizando 12 pares Cada locus fue amplificado de manera individual a partir de 5 µL de ADN en 45 µL de mezcla de reacción de PCR conteniendo: Taq ADN polimerasa 1U, Buffer de PCR 1X, dNTPs 0,2 mM, par de cebadores 0.2 µM, MgCl2 X mM (la concentración depende del locus desde 1,5 a 3 mM), betaína 1M, H2O libre de nucleasas.Para verificar la reacción de PCR se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) (VWR Life Science) con buffer Tris-Acetato-EDTA (TAE) 1X y condiciones de voltaje de 100-120 V por 40 min  los productos de PCR fueron analizados en gel concentrador de poliacrilamida al 6,0% y gel separador al 10% (AppliChem) con buffer TrisBorato-EDTA (TBE) 0,5X. La corrida fue estandarizada a 200 V constante (10 V/cm) por 2 a 4 h. Ambas corridas fueron visualizadas posterior tinción con bromuro de etidio 10 µg/ml (Promega) bajo luz ultravioleta (UV) Los tamaños de los fragmentos amplificados fueron determinados mediante su comparación con marcadores estándar de peso molecular de 50 y/o 100 pb Se utilizó MIRU-VNTRplus para la asignación del genotipo

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