Laboratorios de Biología Celular y Microbiología.

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Laboratorios de Biología Celular y Microbiología

Departamento de Ingeniería Química

Laboratorio 2 – Proteínas

Realizado 23 de febrero 2016 a las 11:10 am – 1:00 pm

Presentado por: Paola Andrea Alpala Cuaspa, paalpalacu@unal.edu.co; Norma Lucia Medina Pimentel, nlmedinap@unal.edu.co; Leidy Carolina Blanco Barragán, lecblancoba@unal.edu.co

Supervisor: Juan Carlos Higuita, jchiguitae@unal.edu.co

Resumen

En esta práctica se utilizaron dos métodos para el proceso cualitativo y cuantitativo  de proteínas; se  realizó un trabajo de investigación mediante el cual se expone  las diferentes formas de reconocer la presencia de las proteínas en sustancias mediante los métodos  Biuret y  Bradford. Para lograr identificar las proteínas  y la desnaturalización en las muestras  agua, albúmina, leche entera y deslactosada se utiliza el reactivo de Biuret; el cual contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (NaOH). Con el objetivo de que halla la  formación de un compuesto de color violeta que indica presencia de proteínas.  Con el método   de Bradford  se  realizó una curva estándar, la cuantificación de tres muestras problemas  diferentes factores de disolución  baja y alta concentración, respectivamente, con el fin de obtener la concentración real de la muestra problema, utilizando la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber la luz.

INTRODUCCIÓN

Se define como proteínas a las moléculas que se encuentran formadas por cadenas lineales de aminoácidos por medio de enlaces covalentes llamados peptídicos que se establecen entre los grupos carboxilos de un aminoácido y el grupo amino; las proteínas también  tienen un elevado peso molecular y a la vez están  destinadas a proporcionar aminoácidos y ser benéficas en nuestro organismo, presentan varias funciones; como  ser transportadoras, enzimáticas, hormonales, reguladoras, entre otras.

Para el reconocimiento de proteínas y desnaturalización  se realizó un trabajo de investigación  cualitativo y cuantitativo previo en laboratorio. El método cualitativo se basa en  la identificación de las proteínas, uno de los procesos es el de   BIURET  cuando una proteína reacciona con el cobre II sulfato (azul) hay  formación de un complejo de color violeta que  indica que la prueba es positiva.

En el método cuantitativo se establecen varios patrones con el fin de establecer una curva patrón absorbancia vs concentración; los datos que arroja la gráfica permite obtener el dato de la concentración  para esto uno de los métodos utilizados es el  de Bradford este se basa en la unión de un colorante en solución ácida (azul); Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.

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INTRODUCCIÓN

Se define como proteínas a las moléculas que se encuentran formadas por cadenas lineales de aminoácidos por medio de enlaces covalentes llamados peptídicos que se establecen entre los grupos carboxilos de un aminoácido y el grupo amino; las proteínas también  tienen un elevado peso molecular y a la vez están  destinadas a proporcionar aminoácidos y ser benéficas en nuestro organismo, presentan varias funciones; como  ser transportadoras, enzimáticas, hormonales, reguladoras, entre otras.

Para el reconocimiento de proteínas y desnaturalización  se realizó un trabajo de investigación  cualitativo y cuantitativo previo en laboratorio  El método cualitativo se basa en  la identificación de las proteínas, uno de los procesos es el de   BIURET  cuando una proteína reacciona con el cobre II sulfato (azul) hay  formación de un complejo de color violeta que  indica que la prueba es positiva.

En el método cuantitativo se establecen varios patrones con el fin de establecer una curva patrón absorbancia vs concentración; los datos que arroja la gráfica permite obtener el dato de la concentración  para esto uno de los métodos utilizados es el  de Bradford este   Se basa en la unión de un colorante en solución ácida (azul); Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.

MATERIALES Y MÉTODOS

MUESTRA PROBLEMA (Procedimiento No.1)

•  Leche deslactosada.

•  Leche entera.

PROCEDIMIENTO No. 1 (Identificación de proteínas)

Este procedimiento se realizó tomando cuatro tubos de ensayo los cuales al tubo no. 1 se le adicionan 2 ml de agua destilada, al tubo no. 2 se le adicionan 2 ml de albúmina, a los tubos 3 y 4 se adicionaron 2 ml de leche deslactosada y entera respectivamente. Posteriormente a esto, los cuatro tubos se les agregaron 5 gotas de sulfato de cobre y 2 ml de hidróxido de sodio 3M.

Luego de la preparación de todos los tubos de ensayo con sus respectivos contenidos se dejaron reposar durante dos minutos en los cuales se observaron todas las reacciones ocurridas.

Para este procedimiento los materiales requeridos fueron cuatro tubos de ensayo, gradilla, una pipeta de 2ml, pipeteador, frasco lavador, agua destilada, sulfato de cobre e hidróxido de sodio 3M.

 PROCEDIMIENTO No. 2 (Cuantificación de proteínas)

Este procedimiento se llevó a cabo realizando una solución patrón a distintas concentraciones a consecuencia de varias diluciones. Por lo tanto se tomaron 6 tubos de ensayo los cuales al tubo (1) se le adicionaron 4 ml de la solución patrón, al tubo  (2) se le adicionaron 2 ml del contenido del tubo (1) más 2 ml de agua destilada, y así respectivamente se fue haciendo el tren dilución hasta llegar al tuvo (6); por último se realizó la preparación de un blanco, adicionando 2 ml de agua destilada al tubo (6), causando así que queden varias soluciones a partir de una solución patrón a distintas concentraciones.

Ya en la preparación de la muestra problema para posteriormente medir la absorbancia se tomaron 3 tubos de ensayo a los cuales a los tres se le adicionaron 0.5 ml de esta, al tubo (1) se le adicionaron 3 ml,  al tubo (2) 5 ml y al tubo (3) 10 ml de agua destilada.

Una vez preparados todos los patrones se dejaron reposar durante 7 minutos una vez pasado este tiempo el contenido de cada tubo se traspasó  a las celdas correspondientes para medir la absorbancia de cada patrón.

Resultados y discusiones

Proceso cualitativo para la identificación de proteínas:

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Imagen 1. Prueba de Biuret

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Agua, albumina, leche entera y deslactosada                          Soluciones + CuSO4

Imagen 3. muestra de proteinas

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    Soluciones+ CuSO4 + NaOH

En este proceso cualitativo se  utilizó CuSO4  y NaOH. El Hidróxido de sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio Alcalino  necesario para  determina si la muestra de estudio resulta positiva o negativa;  una disolución de sulfato de cobre  en medio alcalino reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo  por lo tanto la   reacción de sulfato de cobre, el reactivo de color azul (evidenciado en la imagen (2) y (3), respectivamente) cambia a violeta en presencia de proteínas en medio alcalino[1]; como se puede observar en las muestras la albúmina como las muestras problemas al agregar los reactivos de  CuSO4  y NaOH hay cambio de color violenta (imagen (1) y (2)) lo cual significa la presencia de proteínas.

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