Laboratorio de Bioquimica: Enzimas.

Bioquímica II

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas que catalizan casi todas las reacciones bioquímicas y funcionan incrementando la velocidad de las reacciones enérgicamente favorables, sin afectar la dirección o el equilibrio entre productos y reactivos. La favorabilidad de un proceso no se afecta por la presencia de catalizadores, simplemente se alcanza con más velocidad el estado de equilibrio.  Los productos químicos que experimentan un cambio en una reacción catalizada por una enzima se denominan sustratos y el resultado de dicha reacción es el producto (Darnell et al, 1988).

Las enzimas son unas de las proteínas con mayor especialización; poseen varias propiedades, entre ellas las más importantes son su poder catalítico y su especificidad; esta última es el resultado de la afinidad de la enzima por su sustrato y solo actúa en una determinada molécula de él, gracias a la acomodación del sustrato en su sitio activo; la especificidad de las enzimas se pone de manifiesto en las diferentes velocidades y está muy relacionada con su actividad catalítica (Peña, 2004).  La velocidad de una reacción catalizada por una enzima es a menudo millones o billones de veces mayor que una reacción no catalizada (Darnell et al, 1988); además, se puede ver afectada por cuatro factores: la concentración del sustrato, la presencia de inhibidores y su cantidad, la temperatura y el pH. La cinética de las reacciones catalizadas por enzimas se determinan por las propiedades del catalizador (Nelson & Cox, 2006).

Al ser proteínas, la actividad catalítica de las enzimas depende de la integridad de su conformación nativa, si se desnaturaliza o se disocia en sus aminoácidos constituyentes, perderá su actividad catalítica. Para su actividad, algunas enzimas solo necesitan sus residuos aminoácidos; sin embargo, hay otras que necesitan ayuda adicional, un componente químico llamado cofactor u orgánico llamado coenzima (Nelson & Cox, 2006).

La rapidez de una reacción enzimática depende de varios factores, como temperatura, pH, fuerza iónica, concentración tanto de la enzima como del sustrato, tiempo, entre otros. La rapidez aumenta al elevarse la temperatura hasta determinado punto; arriba de este decrece debido a que la enzima se desnaturaliza, debido a que destruye los enlaces de hidrógeno y la estructura terciaria de esta. También tiene un pH determinado al cual la rapidez de reacción es máxima, a causa de complejos equilibrios acido-base; además esta velocidad de reacción también puede depender de la fuerza iónica y del tipo de amortiguador que se use (Christian, 2009).

Las fosfatasas son un conjunto de enzimas hidrolasas, presente en casi todo el organismo de la mayor parte de los seres vivos, pero uno de sus puntos de mayor concentración es el intestino. Tienen la función de hidrolizar los esteres fosfato de los fosfolípidos. Si una fosfatasa se activa en medio ácido se denomina fosfatasa ácida y si lo hace en medio alcalino se llama fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) cataliza la hidrolisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo sobretodo entre pH 9.0 y 10.5, liberando fosfato inorgánico al medio (desfosforilación) y se inactiva a temperaturas muy altas (Bárcena et al, 2009), sobre todo a temperaturas superiores a 50°C (Bennington, 2000).

Uno de los métodos para determinaciones cinéticas es el método de Bessey-Lowry-Brock, en él la fosfatasa alcalina desdobla el sustrato p-Nitrofenilfosfato para liberar p-Nitrofenol. Se agrega NaOH para detener la reacción y convertir el producto p-nitrofenol en su forma coloreada. La cual es determinada fotométricamente (Bennington, 2000).

El objetivo principal de la práctica consistió en determinar mediante el efecto  de algunos factores como: concentración enzima-sustrato, temperatura y pH, algunas de las características cinéticas de la enzima fosfatasa alcalina; elaborando gráficos de éstos parámetros.

PROCEDIMIENTO

Para la práctica se llevó a cabo tres procedimientos, los cuales son:

• Curva de calibración de p-nitrofenol: Se toman 5 tubos de ensayo y se preparan cada uno de acuerdo a la tabla 1, solo que no se le agrega la enzima y se marcan con la cinta de enmascarar. Posteriormente se realiza la calibración del espectrofotómetro con el blanco y utilizando una longitud de onda de 405nm. Se determina la transmitancia y absorbancia de cada solución. Al final con una muestra problema de PNF (p-nitrofenol ) se toma la transmitancia, absorbancia y concentración. Se toman todos los datos y se hace la relación entre concentración y absorbancia, y entre concentración y transmitancia.
• Efecto de la temperatura: Se toman 5 tubos de ensayo y se preparan cada uno de acuerdo a la tabla 2 sin la enzima y se marca cada uno con la cinta de enmascarar. Se realiza una preincubación de cada tubo, durante 3 minutos con su respectiva temperatura. Posteriormente se agrega 0.1ml de la enzima FAL (Fosfatasa alcalina) y se realiza una incubación por 3 minutos, se saca del baño maría, se seca y se lee la absorbancia. Se toman todos los datos y se registran en la tabla.
• Efecto del pH: Se preparan los 7 tubos de ensayo de acuerdo a la tabla 3 sin la enzima y se marca cada uno con la cinta de enmascarar. Se realiza una preincubación de cada tubo, durante 3 minutos a 37 C°, luego se le agrega 0.1ml de la enzima FAL (Fosfatasa alcalina) y se realiza la incubación de 3 minutos. Se sacan del baño maría y se secan, con el blanco se realiza la calibración del espectrofotómetro y luego se toma la absorbancia y transmitancia de cada solución. Se registran todos los datos tomados en la tabla.

CÁLCULOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Valores de absorbancia y transmitancia de la enzima.  Se muestran los valores obtenidos con el espectrofotómetro de distintas absorbancias y sus respectivas absorbancia. A demás de los valores de la concentración.

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