Lactobacilos

1ª. EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS -2007– MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION

Las bacterias son organismos muy versátiles. Presentan un gran potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias inorgánicas hasta materias orgánicas sumamente complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecológicos con temperatura, acidez o tensiones de oxígeno extremas.

Es muy difícil estudiar microorganismos en forma individual; lo más práctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.

* MEDIO DE CULTIVO es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para la síntesis y mantenimiento de su protoplasma.

• CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.

Los cultivos pueden ser:

a) puros o axénicos, cuando la población está constituida por una única clase de microorganismos.

b) mixtos, cuando la población está constituida por más de una clase de microorganismos.

En la actualidad, la mayoría de los gérmenes patógenos se pueden cultivar fuera de su hábitat natural. Ciertos parásitos obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales; requieren células vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN LA FUENTE DE ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN

Al diseñar un medio de cultivo es importante conocer los requerimientos de energía y carbono de las especies a cultivar.

- Fuente de energia, puede ser:

- luz: energía luminosa que se convierte en energía química. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan fototrofos.

- reacciones de oxido-reducción a partir de compuestos químicos inorgánicos u orgánicos. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan quimiotrofos.

Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:

- respiración aerobia: aceptor final de electrones O2

- respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-, SO4=, CO2, fumarato

- fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

- Fotosíntesis

- Fuente de carbono, puede ser:

- CO2: los microorganismos que utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.

- compuestos orgánicos carbonados (azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

De la combinación de estas categorías surge la sig. clasificación de microorganismos:

Fuente de energía Fuente de carbono Categoría Ejemplos

Luz CO2 Fotoautotrofos Algas,

cianobacterias

acetato Fotoheterotrofos Alg. bacterias

Reacciones CO2 Quimiolitotrofos Bacterias oxidantes de

de óxido-reducción H2, del azufre, de Fe2+

compuestos orgánicos Quimioorganotrofos Hongos, bacterias

Fotoautotrofos = fotolitotrofos

Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se diseña la fórmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qué categoría está incluido el microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos inorgánicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgánicos para quimioorganotrofos.

Un medio de cultivo está integrado por:

1. Elementos energéticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):

• Fuente de carbono: puede ser CO2 ó compuestos carbonados orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energía por excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:

- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;

- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;

- disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa;

- trisacáridos como rafinosa;

- polisacáridos como almidón, glucógeno;

- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y

- glucósidos como salicina, y esculina.

• Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando moléculas sencillas como NO3-, NH3 ó N2. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas.

** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina, harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos, tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.

La hidrólisis ácida puede ser realizada con HCl ó H2SO4 y presenta las siguientes desventajas:

- el triptofano se destruye

- se pierde el 10% de vitaminas presentes

- desaparecen casi completamente los polipéptidos

Se prefiere la hidrólisis enzimática que emplea diferentes proteasas actuando a pH específicos, ej. papaína a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.

Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo, cumplen la función de fuente de carbono y energía. Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carácter “buffer” al medio.

Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables.

• Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos, fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (gránulos de volutina)

• Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina. En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes coenzimas.

• Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes que estabilizan macromoléculas aniónicas. K+ actúa como coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintéticos. Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.

• Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.

b) Microelementos o trazas (mg ó ug/ml): suelen estar naturalmente presentes como contaminantes de los macroelementos.

* Frecuentemente esenciales:

Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulación.

Fe: cofactor de enzimas para la función respiratoria en citocromos, catalasa y flavoproteínas. En adecuada concentración favorece la síntesis de toxina diftérica.

Co: interviene en la síntesis de vitamina B12.

Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.

• Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.

• Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

2. Factores de crecimiento

Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células animales.

Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas, alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.

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