Linfocitos

PARAMETROS CITOGENÉTICOS EVALUADOS EN CROMOSOMAS HUMANOS A PARTIR DEL CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS

MATERIALES Y MÉTODO

Ensanyo: Tinción diferencial de Cromátidas Hermanas(ICHs)

A partir de donadores clínicamente sanos, se extrae por punción venosa 5 ml de sangre periférica con una jeringa heparinizada (PiSA, México). Posteriormente 0.5 ml de está sangre se cultiva en 4.75 ml de medio RPMI-1640 (Sigma, USA) suplementado con 0.25 ml de fitohemaglutinina M (Sigma, USA), y se incuban durante 72 hrs a 37°C.

Posteriormente a las 24 hrs de incubación, se adiciona 0.1 ml de la solución bromodesoxiuridina (BrdU, Sigma, USA) en una concentración final de 5 µg/ml y a las 48 hrs se aplicó el tratamiento que consistió en añadir: 0.33, 0.66, 1.00 µg/ml la Casiopeína IIgly. Se utilizo un control negativo (sin tratamiento) y un positivo de Mitomicina C (200 ng/ml) (Sigma, USA).

A las 70 hrs se adiciona 0.1 ml de una solución de colcemida (IRVINE SCIENTIFIC, USA) en una concentración final de 4 µg/ml y se deja actuar por dos horas. A las 72 hrs los cultivos se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos. El paquete celular se somete a un choque hipotónico con una solución de KCl (Beker, México) 0.075M, durante 20 mín a 37 °C. Se realiza otra centrifugación y las células se fijan en una solución de metanol-ácido acético (Beker, México), frío y recién preparado (3:1) con tres cambios en la mezcla fijadora 15, 10 y 5 min. En el último cambio se resuspende el botón celular en 0.5 ml de fijador.

Luego de esto se procede a realizar las preparaciones por goteo y se dejan secar al aire. Las laminillas con el material genético se irradian con luz ultravioleta durante 20 minutos sumergidas en una solución acuosa. Trascurrido este tiempo se incuban por 20 minutos en una solución citrato salina 2xSSC (Cloruro de sodio 0.30M (Sigme, USA) + Citrato de sodio 0.03M (Beker, México)) a 50 °C en una caja coplin. Se lavan las preparaciones con agua destilada y luego se tiñen con Giemsa (Sigma) (1:10) durante 10 minutos. Se lavan en agua corriente y se dejan secar al aire.

ENSAYO DE MICRONÚCLEOS (MN)

SIEMBRA

Realizar cultivos de linfocitos humanos de sangre completa proveniente de donadores clínicamente sanos (al final de los tratamientos, se separan los linfocitos, del resto de las células, Fenech, 2000, Fenech et al., 2003), tratados por separado a las 48 horas de iniciados, con tres concentraciones diferentes de cada una de las Casiopeínas III-ia, IIgly y Igly. Se contará con un testigo negativo (sin tratamiento) y uno positivo con Mitomicina C (200 ng/ml). La Citocalacina B (6 μg/ml), se adicionará 44 horas de haberse iniciados los cultivos previamente estimulados con fitohemaglutinina.

COSECHA

Los linfocitos binucleados se cosechas después de 28 horas de haber adicionado la Citocalacina B, tiempo en el cual se procederá a separa a los linfocitos del resto de las células, usando el gradiente de Ficoll (Fenech, 2000). Separados los linfocitos se tomará una alícuota para, evaluar la viabilidad con el ensayo de exclusión de azul tripano. Los restantes linfocitos aislados se fijaran por 10 min., con metanol absoluto.

TINCIÓN

Las preparaciones (tres por tubo) se elaboraron por goteo. Finalmente se realizará una tinción convencional May Grünwald-Giemsa. Cada prueba para las diferentes concentraciones de Casiopeínas y, testigos tanto positivo como negativo, se llevará a cabo por duplicado y con dos repeticiones más.

EVALUACIONES y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ICHs:

Para el análisis de la frecuencia de ICHs, se analizan 30 células en metafase bien extendidas de segundo ciclo duplicación y se cuantifico el número y tipo de ICHs. Considerando a los intercambios terminales como uno y a los intersticiales como dos. (Figura,1)

Para la determinación del Índice Mitótico (IM) se evaluaron 1000 células por tratamiento, incluyendo células en interfase y metafase, de acuerdo

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