Los grandes Métodos de detección de agentes patógenos adquiridos a través de los alimentos basados en el uso de ácidos nucleicos

Identificación de virus y bacterias asociados a enfermedades transmitidas a través de los alimentos: diagnóstico por PCR tiempo real de enfermedades gastrointestinales.

MenC Yessica Parera Valadez

Contenido

Introducción        3

Objetivos        4

Métodos de detección de agentes patógenos adquiridos a través de los alimentos basados en el uso de ácidos nucleicos        4

Ventajas y desventajas        7

Diagnóstico por PCR tiempo real de enfermedades gastrointestinales        10

Fundamento        10

Formatos de detección inespecíficos:        11

Formatos de detección específicos:        12

Instrumentación        15

Análisis de datos        15

Ensayos de cuantificación        17

Normalización y controles endógenos        18

Aplicación en la detección de patógenos        21

Uso de métodos moleculares dependientes de ácidos nucleicos en casos específicos        22

Bibliografía        23

Relación de Tablas

Tabla I. Bacterias y virus  patógenos más comunes causantes de enfermedades gastrointestinales y los genes útiles para su detección.        21

Relación de Figuras

Figura 1. Principio de detección utilizando SYBR Green I.        11

Figura 2. Principio de detección de AmpliFlour.        12

Figura 3. Principio de detección utilizado por el método Taqman.        13

Figura 4. Principio de detección utilizando molecular beacons.        13

Figura 5. Principio de detección utilizando sondas Scorpions.        14

Figura 6. Principio de detección utilizado por sondas FRET.        14

Figura 7. Curva de amplificación.        15

Figura 8. Protocolo general de la técnica de PCR en tiempo real (Aguilera et al., 2014).        20

Introducción

Las interacciones entre microorganismos y macroorganismos (plantas y animales) se encuentran de manera natural, son constantes y forman parte de la evolución misma. Los alimentos que consume el hombre se componen de plantas y animales, por lo tanto, es comprensible creer que dichos alimentos contengan microorganismos que interaccionen con ellos. Así mismo, los microorganismos utilizan nuestros alimentos como fuente de nutrientes puesto que una de sus funciones principales es la conversión de las formas reducidas de carbono, nitrógeno y azufre, las cuales a su vez son utilizadas por otros organismos.  Sin embargo, a lo largo del proceso de alteración de los alimentos, estos pueden volverse no aptos para nuestro consumo.  Cuando se trata de microorganismos patógenos, su asociación con nuestros alimentos es peligrosa desde el punto de vista del sector salud (Frazier y Westhoff, 1993).

Las enfermedades transmitidas por los alimentos  (ETA) surgen debido a la ingestión de alimentos y/o bebidas contaminados con microorganismos patógenos que afectan la salud del consumidor. Los síntomas más comunes son diarreas y vómitos, pero también se pueden presentar otros como choque séptico, hepatitis, cefaleas, fiebre, visión doble, entro otros.  EL término ETA normalmente es aplicado para designar tanto enfermedades producidas por la ingestión de toxinas producidas por microorganismos,  como para aquellas debido a la infección del hospedero a través del tracto intestinal. Hasta la fecha se han descrito más de 250 ETA, siendo la mayoría infecciones causadas por bacterias pertenecientes a los géneros Shigella, Vibrio,  Yersinia, Listeria, Staphylococcus, Bacillus,   Campylobacter y Salmonella, así como la cepa O157:H7 de Escherichia coli (Gonzáles-Flores y Rojas-Herrera, 2005; Law et al., 2015).  Por otra parte, los virus han sido reconocidos como la mayor causa de infecciones no bacterianas alrededor del mundo. Dentro de los más comunes se encuentran los norovirus (NoV), hepatitis A (HAV), hepatitis E (HEV), rotavirus (RV), astrovirus, sapovirus, adenovirus, Aichi virus,  enterovirus y picornavirus (D’Souza, 2013).

La detección e investigación de las ETA constituyen un reto de salud pública  pues consiste en obtener, identificar y valorar de manera oportuna y eficaz información médica, muestras del paciente infectado, muestras del alimento contaminado, análisis microbiológicos, análisis de laboratorio, entre otros, para conocer el tratamiento y prevención adecuada.  Los diagnósticos convencionales  de las enfermedades gastrointestinales comprenden el uso de medios de cultivo específicos, pruebas bioquímicas  y técnicas de microscopía,  sin embargo, dichas aproximaciones son lentas,  requieren largas jornadas de trabajo y posee un costo elevado. En años recientes, el uso de técnicas moleculares en el diagnóstico de patógenos  gastrointestinales e inocuidad de los alimentos ha ganado auge debido a la eficacia que estas técnicas proveen en cuestión de tiempo, mínima manipulación de la muestra y relativamente bajos costos  (Gonzáles-Flores y Rojas-Herrera, 2005;  De Boer et al., 2010)

En el  presente trabajo  se conocerán  algunas técnicas moleculares eficientes en la detección de patógenos bacterianos o víricos adquiridos a través de los alimentos, así como ventajas y desventajas para su uso en casos específicos.    

Objetivos

• Documentar las principales técnicas de detección de agentes patógenos bacterianos y virales utilizando herramientas moleculares dependientes de ácidos nucleicos, así como las ventajas y desventajas que presentan.
• Conocer y comprender el uso y aplicación de la técnica molecular PCR en tiempo Real para el diagnóstico de las enfermedades transmitidas por los alimentos.
• Comparar el uso de dichas herramientas moleculares en casos de enfermedades gastrointestinales.

Métodos de detección de agentes patógenos adquiridos a través de los alimentos basados en el uso de ácidos nucleicos

Debido a los problemas de salud pública ocasionados por agentes patógenos presentes en los alimentos, la necesidad de desarrollar métodos de identificación rápidos y altamente sensitivos ha dirigido las investigaciones al campo de la biotecnología mediante la aplicación de técnicas moleculares que involucran tanto al  ADN como al ARN del microorganismo patógeno.  Dichas técnicas se llevan a cabo hibridizando una secuencia de nucleótidos blanco a un oligonucleótido sintético complementario (Rodríguez-Lázaro y Hernández, 2015). Dentro de las metodologías más populares encontramos las siguientes:

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): método molecular más usado comúnmente. La PCR multiplica exponencialmente una secuencia específica de ADN de doble cadena sintetizando grandes cantidades de un segmento específico de ADN a partir de cantidades inferiores del ADN de la muestra. Comprende varios ciclos divididos en tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión del cebador. Estos tres pasos constituyen un ciclo, el cual se repite cierto número de veces para obtener millones de copias del fragmento de interés. La reacción se lleva a cabo gracias a la presencia de desoxirribonucleótidos  trifosfatos, oligonucleótidos específicos, la enzima polimerasa y una solución tampón (Rodríguez-Lázaro y Hernández, 2015).
• PCR múltiplex: técnica que sigue los mismos fundamentos que la PCR convencional pero que permite la detección simultánea de más de una secuencias de nucleótidos en una sola reacción mediante el empleo de dos o más parejas de oligonucleótidos o cebadores. En este caso, los cebadores deberán reaccionar a una temperatura de fusión similar. Los tamaños de los productos amplificados de la PCR deberán también ser semejantes pero distinguibles, entre valores de 200 a 500 pares de bases (Zhao et al.,  2014).
• PCR en tiempo real: la metodología es muy similar a la PCR convencional, pero con la ventaja de poder monitorear el progreso de la reacción a medida que ésta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso y no al final de la reacción. En esta técnica se utilizan moléculas de un reportero fluorescente que sirve  para monitorear la amplificación de los productos durante cada ciclo de reacción, siendo proporcional la intensidad de la fluorescencia a la cantidad de productos amplificados.  Se trata de una combinación de los pasos de amplificación de ADN con la detección en un único ensayo evitando así tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos amplificados. También es posible utilizar varios cebadores diferentes en la misma reacción al igual que en la PCR Múltiplex.  De igual manera si se utiliza ARN como molécula blanco estaríamos hablando de una retrotranscripción de PCR en tiempo real (Law et al, 2015).
• Chips microfluídicos: el término mucrofluídico se refiere a la tecnología necesaria para mover cantidades muy pequeñas de líquido (nanolitros y picolitros) a través de canales microscópicos en un dispositivo. Primero el ADN es extraído y purificado para su amplificación mediante PCR o NASBA, los productos pueden ser visualizados mediante fluorescencia. Cabe señalar que todos los pasos ocurren dentro del chip, por lo que se puede usar en muestras directamente (Zhao et al.,  2014).
• Amplificación basada en la secuencia  de ácidos nucleicos (NASBA): es una tecnología independiente de oligonucleótidos que amplifica secuencias de nucleótidos en una  reacción sencilla bajo condiciones isotérmicas de temperatura. Esta característica permite el uso de dos o tres enzimas de forma simultánea: transcriptasa inversa, RNasa H y una ARN polimerasa dependiente de ADN; de esta forma se imita el ciclo de vida retroviral, produciendo ARN a partir de ADN (Fratamico y Bayles, 2005).
• Microarreglos de ADN: consiste en múltiples fragmentos pequeños de ADN complementario (cada uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un soporte físico. Cada fragmento están diseñados para hibridar con una parte específica de una secuencia de adn.  La muestra con fragmentos de nucléotidos (ADN, ARNm o ADNc) son etiquetados mediante un marcador fluorescente  y desnaturalizados para generar cadenas sencillas. Dichos fragmentos hibridarán en el soporte junto con su fragmento complementario y la seña será visualizada mediante la señal fluorescente producto de la hibridación (Wang y Salazar, 2015).  
• Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos  mediada por LOOP (LAMP): el método LAMP está basado en el principio de síntesis de ADN por desplazamiento de cadena, el cual es llevado a cabo por una polimerasa con alta actividad de desplazamiento (ADN polimerasa Bst) de cadena y un sistema de dos cebadores internos y dos cebadores externos para reconocer un total de seis secuencias distintas en el ADN blanco. Estructuras de ADN con múltiples bucles (loops) de diferentes tamaños son los productos de esta reacción (Sánchez et al., 2014).

Ventajas y desventajas

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