PROYECTO DE TESIS MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LA ENXIMA β-LACTAMASA OXA-24 POR PARTE DE INHIBIDORES TIPO DBO

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UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN

Escuela de Graduados

Programa de Doctorado en Ciencias con Mención en Química

PROYECTO DE TESIS

MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LA ENXIMA β-LACTAMASA OXA-24 POR PARTE DE INHIBIDORES TIPO DBO

Académico Guía

Dr. Eduardo Delgado Ramirez

Concepción, Junio 2019

I. ASPECTOS GENERALES

Escriba 3 palabras claves que identifiquen el proyecto

I.2. INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE

I.3. INSTITUCIONES PATROCINANTES: Unidad(es) Ejecutora(s)

1. RESUMEN

El descubrimiento de la penicilina y sintesis de sus derivados, es sin duda uno de los grandes avances de la mecidina moderna, aumentando significativamente la esperanza de vida tanto en humanos como en animales. Sin embargo, las bacterias han desarrollado mecanismos de resistencia  frente a estos, en el cual el más importante es la producción de enzimas β-lactamasas por parte de bacterias Gram-negativas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactámico de penicilinas, cefalosporinas y carbapenémicos, inactivándolos de forma irreversible y con ello haciendolos ineficientes para la muerte bacterial. Actualmente, alrededor de 1000 enzimas β-lactamasas han sido documentadas comprendiendo variadas clases estructurales y un amplio rango de sustratos y eficiencia catalítica. Entre las enzimas serina β-lactamasas, las enzimas de clase D, tambien denominadas OXAs (Oxacilinasas), han mostrado un aumento considerable de nuevas variantes en el ultimo tiempo. Son frecuentemente encontradas en microorganismos tales como Acinetobacter baumanii y Pseudomonas aeruginosa, los cuales representan dos de los patógenos mas dificiles de tratar, debido a que a menudo presentan multi-resistencia a antibioticos, amenazando significativamente la salud humana. En general, las enzimas β-lactamasas de clase D no son inhibidas por inhibidores β-lactámicos, tales como: acido clavulánico, tazobactam y sulbactam, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos inhibidores. En este aspecto se han creado nuevas familias de inhibidores de β-lactamasas no β-lactámicos tales como: diazabiciclooctanos (DBOs) y boronatos ciclicos, los cuales no contienen un anillo β-lactámico dentro de su estructura química. Los compuestos tipo DBO mas relevantes en cuanto a su amplio espectro de acción  frente a enzimas serina β-lactamasas son: Avibactam y ETX2514. A diferencia del inhibidor ETX2514, Avibactam presenta una menor eficacia contra infectiones causadas por el microorganismo multi-resistente Acinetobacter baumannii, el cual produce enzimas β-lactamasas del tipo OXA-24 como mecanismo de resistencia.

A pesar de la cantidad de artículos sobre el mecanismo de inhibición de las enzimas β-lactamasas por parte de inhibidores β-lactámicos y no β-lactámicos, no existen estudios quimico computacionales sobre el mecanismo de inhibición de enzimas β-lactamasas de tipo OXA-24 por parte de inhibidores no β-lactámicos de tipo DBO, tales como avibactam y ETX2514, lo cual sera objeto de estudio en esta tesis. Este estudio incluirá simulaciones de dinámica molecular, para posteriormente explorar la superficie de energia potencial (SEP), mediante calculos híbridos QM/MM (Quantum Mechanics/Molecular Mechanics), en donde la zona QM estara comprendida por el inhibidor y los residuos aminoacidicos Ser81, Lys84, Ser128 y Lys218, mientras que la zona MM incluirá el resto de la enzima.

El objetivo principal de este estudio es explicar como ocurre la etapa de acilación y desacilación en los sistemas OXA-24/DBO anteriormente señalados, esto es determinar si el mecanismo es concertado o por etapas, sincrónico u asincrónico; así tambien se evalaruán la o las correspondientes barreras de energías de activación. Ademas se estudiara el rol de los residuos aminoacídicos en base a las interacciones entre estos y el inhibidor. Se pretende tambien conocer si existe o no un mecanismo único para todas las enzimas serina β-lactamasas frente a esta nueva clase de inhibidores.

Se espera que estos resultados sean de interés para el desarrollo racional de nuevos antibióticos e inhibidores de β-lactamasas.

1. INTRODUCCIÓN

El descubrimiento de la penicilina y sintesis de sus derivados, es sin duda uno de los grandes avances de la mecidina moderna(i), aumentando significativamente la esperanza de vida tanto en humanos como en animales. Sin embargo, las bacterias han desarrollado mecanismos de resistencia (ii) frente a estos, en el cual el más importante es la producción de enzimas β-lactamasas por parte de bacterias Gram-negativas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactámico de antibioticos tales como: penicilinas, cefalosporinas y carbapenémicos(iii), inactivándolos de forma irreversible(iv) y con ello haciendolos ineficientes para la muerte bacterial(v).

Existen variadas formas de clasificar las enzimas β-lactamasas(), siendo la más común la clasificacion de Ambler(vi), la cual establece que existen 4 clases de enzimas β-lactamasas, A, B, C y D, basadas en la similitud de sus secuencias de aminoácidos y especificidad frente a algun determinado tipo de sustrato(vii). Las enzimas de clase A, C y D, denomindas serina β-lactamasas(viii), usan un residuo de serina en la catalisis covalente actuando como nucleofilo frente al carbonilo β-lactamico, mientras que en las enzimas de clase B, denominadas metalo-β-lactamasas(ix), requieren de iones Zinc(2+), los cuales activan una molecula de agua en el sitio activo para el ataque nucleofílico e hidrólisis.

En serina β-lactamasas, el mecanismo enzimático incluye etapas de acilación y desacilación, en ambos se involucra una transferencia protónica facilitada por una catálisis ácido-base general. En la etapa de acilación, el residuo aminoacídico serina responsable del anclaje covalente, se activa mediante abstracción del hidrógeno hidroxílico por parte de un grupo con caracteristicas ácido-base, con el subsecuente ataque al grupo carbonílico del anillo β-lactámico, formando el intermediario acil-enzima. Posteriormente, en la etapa de desacilación, una molecula de agua activada mediante desprotonación por parte de un residuo aminoacídico con caracteristicas ácido-base, ataca de forma nucleofílica al grupo carbonílico del anillo β-lactámico del intermediario acil-enzima, liberando el sustrato β-lactámico hidrolizado y regenerando la enzima(), Figura 1.

Actualmente, alrededor de 1000 enzimas β-lactamasas han sido documentadas comprendiendo variadas clases estructurales y un amplio rango de sustratos y eficiencia catalítica(). Entre las enzimas serina β-lactamasas, las enzimas de clase D, tambien denominadas OXAs (Oxacilinasas)(x), han mostrado un aumento considerable de nuevas variantes en el ultimo tiempo(xi). Su nombre se debe al hecho de que las primeras enzimas OXAs descritas tenían una tasa de hidrólisis 50% más alta para el antibiótico oxacilina que para la bencilpenicilina(xii), aunque esta generalización ya no es válida (xiii). Son^[a] frecuentemente encontradas en microorganismos tales como Acinetobacter baumanii() y Pseudomonas aeruginosa(xiv), los cuales representan dos de los patógenos mas dificiles de tratar, debido a que a menudo presentan multi-resistencia a antibioticos(), amenazando significativamente la salud humana. Ademas, poseen actividad frente a familias de antibióticos β-lactámicos tales como cefalosporinas de amplio espectro y carbapenemicos(xv), siendo estos la última linea de defensa frente a esta clase de microorganismos(xvi). A pesar de la gran diversidad encontrada en esta clase de enzimas (>400 especies encontradas hasta la fecha)(xvii), existen 2 caracteristicas principales que difieren de las otras enzimas serina β-lactamasas(Clase A y C):

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