Practica De Microbiología

PRÁCTICA 3

Técnica de tinción de Gram y Preparación de caldo Agar agar.

OBJETIVOS

Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos.

Que obtenga la información básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.

Conocer todo el proceso de preparación del caldo nutritivo.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por los que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.

Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los microorganismos sobre una superficie transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos; lo que causará la inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de sus características.

Existen diferentes tipos de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el número y tipo de colorantes utilizados y de los objetivos de estudio. La tinción que hace uso de un solo colorante es la simple. Las tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con características superficiales distintas, por lo que requieren más de un colorante. La más utilizada en bacteriología es la propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas que son útiles para la clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar bacterias de tipo Bacillus y Clostridium.

MATERIALES

1 probeta de 100 mL, 1 mechero, 1 Matráz de Erlenmeyer, asa de platino, portaobjetos, 1 piceta con agua destilada, microscopio óptico, 1 frasco gotero, aceite de inmersión.

Autoclave, canastilla, balanza, 2 pares de guantes, papel toalla, colorantes de Gram, frasco con Agar agar.

PROCEDIMIENTO

Cada equipo de trabajo preparará frotis de los dos tipos de cultivos y harán tinción de gram.

Preparación de frotis

Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.

Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.

Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.

En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza el mismo procedimiento antes descrito.

Fijación del Frotis

Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero.

Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que se dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada

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