Reporte #3: Aminoácidos y proteínas

10 de marzo del 2023

Reporte #3: Aminoácidos y proteínas

Escobar-García E., Legarreta-Armenta L.A., Barraza-Gómez A. & Navarro-Soriano J.A

Resumen: Las proteínas son cadenas polipeptídicas unidas por enlaces peptídicos; están formadas por secuencias de aminoácidos, formadas de un Cα, un grupo carboxilo, amina y una cadena R. En la práctica 6 se realizaron pruebas de aminoácidos (nitroprusiato, nitrosonaftol, ninhidrina). La práctica 7 se realizaron pruebas para identificar proteínas (Biuret, Xantoproteíca). La práctica 8 se buscó la pI de la albúmina, utilizando ácido acético. La práctica 9 se identificaron las proteínas que componen a dos muestras (una de saliva) utilizando la cromatografía de capa fina. En la práctica 10 se realizó la prueba de Biuret a diferentes muestras (agua, muestra, leche, leche ex. proteína y sangre), y se midieron sus absorbancias. La práctica 11 se utilizó el software RasMol para visualizar diferentes características de la lipasa pancreática.

El nitroprusiato dio positivo a tioles, el nitrosonaftol a fenoles y la ninhidrina a aminas libres. El Biuret identifica enlaces peptídicos y la Xantoproteíca a aminas aromáticas. El pI de la albumina es 4.75. La muestra contiene prolina y triptófano, y la saliva prolina, cisteína y un aminoácido no identificado. La muestra de sangre es la que contiene mayor cantidad de proteínas. La lipasa contiene 449 aminoácidos, y actúa con un cofactor (colipasa).

Palabras clave: Aminoácidos, proteínas, identificación, propiedades, bioinformática, modelaje.

INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos son las unidades constituyentes de las proteínas, estas están formadas por un carbono alfa, al que se le une un grupo carboxílico, un grupo amino y un radical, el cual será lo que lo identifique de otros aminoácidos y le de sus propiedades. Se dividen entre polares y no polares, 11 y 9 respectivamente. A un pH neutro, los aminoácidos de una proteína se comportan como zwitterons, ya que l grupo carboxilo es acido, con carga ionizada, y su grupo amino es básico, capturando un protón [1], [2].

Existen diferentes estructuras en las proteínas primeria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos, la secundaria son las interacciones de la cadena polipeptídica, la terciaria es la estructura tridimensional de la proteína y la cuaternaria una estructura por múltiples subunidades proteicas [3], [4].

Las proteínas y las enzimas son esenciales para la salud humana debido a sus diversas funciones en el organismo como la construcción de tejidos, la regulación de procesos metabólicos, cicatrización de heridas, defensa contra infecciones, etc. Sin estos procesos empezaríamos a presentar graves problemas de salud por ellos es importante tener una buena alimentación para que nuestras proteínas y enzimas trabajen correctamente [5], [6].

El modelaje de proteínas es una aplicación de la bioinformática, ya que nos permite visualizar estructuras tridimensionales de las proteínas, y además de proporcionar una vista al nivel atómico del mismo, haciendo posible ver la secuencia de aminoácidos que componen a la proteína. Estos modelos tienen una gran utilidad, ya que permiten realizar simulaciones en investigaciones en laboratorios para poder diseñar experimentos, o para predecir la estructura de una proteína descubierta. El sitio Protein Data Bank (PDB) contiene en su base de datos una gran variedad de proteínas, que pueden ser visualizadas en diferentes softwares, como Cn3D, Jmol, MolScript, o RasMol, por mencionar algunos [7], [8].

MÉTODO

        Práctica 6: Reacciones de identificación de aminoácidos

A lo largo de la práctica, se trabajó con los siguientes aminoácidos: cisteína, tirosina, fenilalanina, cistina, prolina y triptófano.

Experimento #1: Prueba de nitroprusiato de sodio

1. El experimento 1 consistió en preparar 7 tubos de ensayo, uno siendo blanco, y otro el patrón.
2. A los 7 tubos de ensayo se les agrego 0.5 ml de NaCN 5% y 2 gotas de nitroprusiato de sodio 5%, al blanco se le agrego 1 ml de agua destilada, al patrón 1 ml de cisteína, al primer tubo 1 ml de triptófano, al segundo tubo 1 ml de prolina, al tercer tubo 1 ml de fenilalanina, al cuarto tubo 1 ml de cistina y al quinto tubo 1 ml de tirosina.
3. Se observo los cambios de coloración que estos tubos obtuvieron, rosa-rojo dando un resultado positivo.

Experimento #2: Prueba de Nitrosonaftol (P-fenoles sustituidos)

1. Se volvieron a preparar 7 tubos de ensayo, a cada uno se le agrego dos gotas de nitrosonaftol de sodio 5%.
2. Al blanco se le agrego 1 ml de agua destilada, al patrón 1 ml de tirosina, al primer tubo 1 ml de triptófano, al segundo tubo 1 ml de prolina, al tercer tubo 1 ml de fenilalanina, al cuarto tubo 1 ml de cistina y al quinto tubo 1 ml de cisteína.
3. Se mezclaron bien y se calentaron en baño a punto de ebullición durante 5 minutos; se retiraron y se dejaron enfriar.
4. A cada uno se le agrego 3 gotas de ácido nítrico sin mezclar.
5. Se observaron los datos obtenidos, el cambio de color rosa violáceo indicaba que es positiva.

Experimento #3: Reacción de identificación de aminoácidos con ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno)

1. Se volvieron a preparar 7 tubos de ensayo, se le agrego 5 gotas de ninhidrina 1% a cada uno.
2. Al blanco se le agrego 1 ml de agua destilada, al patrón 1 ml de fenilalanina, al primer tubo 1 ml de triptófano, al segundo tubo 1 ml de prolina, al tercer tubo 1 ml de tirosina, al cuarto tubo 1 ml de cistina y al quinto tubo 1 ml de cisteína.
3. Se mezclaron bien los tubos y se calentaron en baño de agua caliente.
4. Se retiraron hasta que se observó un cambio de color.

        Práctica 7: Reacciones de identificación de proteínas

En esta práctica se manejaron las proteínas albumina, peptona, gelatina y tirosina para ambos experimentos.

Experimento #1: Reacción de Biuret

1. Se prepararon 5 tubos de ensayo, a cada uno se le agrego 2 ml de Biuret
2. Al primero 1 ml de agua destilada, al segundo 1 ml de albumina, al tercero 1 ml de peptona al cuarto 1 ml de gelatina y al quinto 1 ml de tirosina.
3. Se agitaron bien los tubos y se dejaron reposar durante 15 minutos; se observaron sus cambios de coloración y su intensidad.
4. Si el cambio de color era un violeta intenso, se identificaría con “++”, si estaba ligeramente colorado, se identificaría con “+”, y si no obtiene un cambio de color, se identificaría con “- “.

Experimento #2: Reacción Xantoproteíca

1. Se volvieron a preparar 5 tubos de ensayo, a cada uno se le agrego 1 ml de HNO3.
2. Al primero 1 ml de agua destilada, al segundo 1 ml de albumina, al tercero 1 ml de peptona al cuarto 1 ml de gelatina y al quinto 1 ml de tirosina.
3. Se mezclaron bien y se calentaron a baño de agua a ebullición durante 5 minutos; se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
4. Mediante estratificación y sin mezclar, se le agregó 1 ml de hidróxido de sodio 5N a todos los tubos.
5. Se observaron los cambios, si se formaba un anillo color amarillo/naranja, indicaba que es un resultado positivo indicado con “+”.

        Práctica 8: Determinación de las propiedades químicas de las proteínas

Experimento #1: Determinación del punto isoeléctrico de la albúmina por adición de un ácido

1. Se realizó la siguiente serie de tubos:

[pic 1]

1. Se mezclaron correctamente y se calculó el pH de cada tubo con la ecuación de Henderson-Hasselbach.

Práctica 9: Separación en capa fina de una mezcla de aminoácidos

1. A una placa, manejada con guantes sin tener contacto directo, se le hicieron 8 marcas separadas por un centímetro en la base con un lápiz.
2. A cada una de estas marcas, a las primeras 6 se les agrego una gota de un aminoácido (cisteína, triptófano, fenilalanina, prolina, cistina y tirosina respectivamente), y a la séptima marca se le agrego una gota de una solución problema con 3 aminoácidos desconocidos, a la octava y última se le agrego una gota de saliva.
3. Se dejaron secar solas, sin soplarle para no contaminar la muestra.
4. La placa se colocó en un recipiente con una solución acuosa, cuidando que los aminoácidos no estén sumergidos en la solución acuosa.
5. La cámara se cerró y se esperó durante 45 minutos. Se retiro la placa y con un lápiz se marcó hasta donde subieron las marcas de los aminoácidos.
6. Se secaron por 5 minutos en un horno a una temperatura de 80 °C.
7. Se retiro la placa y se roció completamente con la solución ninhidrina. Se volvió a introducir al horno durante 5 minutos.
8. Se retiro la placa por última vez y se midió los frentes del solvente y del soluto para cada aminoácido y se calculó su relación de frentes y su factor de retardo.

        Práctica 10: Cuantificación de proteínas séricas

Experimento: Método de Biuret

1. Se prepararon 3 tubos con diferentes reactivos, un tubo blanco, uno patrón y un tubo problema.
2. Al tubo blanco se le añadió agua, suero patrón, suero problema y Biuret en las siguientes cantidades 1 ml. 0.1 ml, 0.5 ml y 3 ml respectivamente.
3. Al tubo patrón se le añadió suero patrón y Biuret en las siguientes cantidades 0.9 ml y 3 ml respectivamente.
4. Al tubo problema se le añadió suero problema y Biuret en las siguientes cantidades 0.5 ml y 3 ml.
5. Adicionalmente se prepararon otros 3 tubos problemas cada uno con 3 ml de Biuret y 0.5 ml de leche normal otro tubo con leche con extra-proteína y por último sangre.
6. Los 6 tubos se mezclaron hasta tener una mezcla homogénea
7. Se calibro el espectrofotómetro a 560 nm con el tubo blanco
8. Se midió la absorbancia de cada tubo en la longitud de onda 560nm y se registraron las absorbancias obtenidas.

        Práctica 11: Modelaje y análisis de proteínas

1. Se descargo e instalo el programa de Rasmol.
2. Se descargo el archivo .PBD de la lipasa para posteriormente abrirlo en Rasmol.
3. Para cambiar el tipo de visualización de la enzima se utilizó el comando wireframe.
4. Se utilizo el comando el comando subunit para que se mostraran las subunidades.
5. Se utilizaron los comandos rotate x, rotate y, rotate z, zoom y translate para una mejor visualización de la enzima.
6. Se obtuvo la secuencia de aminoácidos de la enzima con el comando show squence.

RESULTADOS

Práctica 6: Reacciones de identificación de aminoácidos

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