Salmonella y clostridium

ÍNDICE

1. SALMONELLA

1.1.- Introducción 

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos Gram -, anaerobios facultativos flagelados que no desarrollan cápsula^[1] ni esporas. Está considerado como un bacilo patógeno primario, como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli. Existen alrededor de 2500 serotipos diferentes, clasificados en base a los antígenos O y H.

Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas (Pascual y Calderón, 1999)

Taxonomía

La clasificación de esta especie ha sido complicada, viéndose modificada tras el aporte de estudios moleculares de DNA.

Clásicamente se distinguían tres especies patógenas S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis, que a su vez se subdividían en más de 2000 serotipos en base a los antígenos flagelares H (proteico) y somáticos O (polisacárido). S. typhi posee además un antígeno de virulencia (Vi).[pic 1]

En la actualidad, se han reagrupado en función de su patogenicidad en dos especies: S. enterica y S. bongori, siendo esta última no patógena para el ser humano.

La especie S. entérica, a su vez se divide en seis subespecies:

• I enterica.
• II salamae.
• IIIa arizonae.
• IIIb diarizonae.
• IV houtenae.
• V S. bongori, ya incluida en una especie distinta.
• VI indica.

Y éstas a su vez, en diferentes serotipos. Por ejemplo  S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I), se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. con diferentes serotipos.

Con el fin de simplificar esta terminología, se pueden agrupar en tres divisiones ecológicas:

• Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C.
• Salmonella spp. adaptadas a animales, que pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S. dublin, S. Gallinarum y S. cholerae-suis. 
• Salmonella spp. sin adaptación específica, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, causantes de la mayor parte de las toxiinfecciones.

En la actualidad, de acuerdo con las normas internacionales y al Reglamento Sanitario, la sola presencia de Salmonella en un alimento es causa de rechazo del producto, ya que esta toxiinfección es considerada una de las causas más importantes de enfermedades transmitidas por alimentos responsables de la mitad de todas las infecciones en humanos (CDC, 2013). Existen estudios que demuestran que una baja concentración de Salmonella (100 gérmenes/g) puede causar la enfermedad.

1.2.- Características

Su morfología es de bacilos gruesos y cortos, con un agrupamiento celular en pares u ocasionalmente en cadenas cortas.  

Su tamaño es de 0.6 a 0.7 micras de grosor y 2-3 micras de largo.

Crece a temperaturas comprendías entre 15 y 47ºC con un intervalo de pH entre 4 y 9.1.

Resisten a temperaturas de refrigeración y congelación, así como a la desecación.

Como enterobacterias, poseen algunas características generales de este grupo: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo y suelen ser móviles. Al igual que la Escherichia, son bacterias que se multiplican en el intestino.

No fermentan lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo-oxidasa negativos. Producen ácido sulfhídrico (S typhi es la única que no produce gas en la fermentación de los azúcares).

Salmonella spp. presenta escasa especificidad por el hospedador, ya que se adapta muy bien a los animales y personas. Cuando llega a un alimento es capaz de multiplicarse a gran velocidad (duplicando su número cada 15 minutos a temperaturas superiores a 20ºC).

Estructura antigénica

• Somático O,  lipopolisacárido de la pared celular, es termoestable.

Es la base de la clasificación en subgrupos.

• Flagelar H, de carácter proteico, secuencia de aminoácidos que forma la  flagelina, es termolábil.

Es la base de la clasificación de especies.

• Envoltura Vi, termolábil, responsable de la virulencia de varias especies patogénicas en S. typhi.

Impide la aglutinación de sueros anti O.

Metabolitos

• Endotoxina: toxina presente en la pared celular que sólo se libera tras la lisis de la misma.

Produce fiebre, diarrea y vómitos.

• Enterotoxina: sustancia (proteica) producida por la bacteria que afecta al tracto digestivo.
• Citotoxina: Inhibe la síntesis proteica.

1.3.- Aislamiento e identificación

Los métodos para la detección de Salmonella en alimentos están basados fundamentalmente en que su presencia suele ser menor que la de la flora acompañante. En el laboratorio se consideran todos estos factores permitiendo recuperarla mediante diferentes etapas (Pascual y Calderón, 1999):

Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

Etapa que consiste en la revivificación de las Salmonellas al diluir la muestra alimentaria en agua de peptona tamponada (APT) que mantiene unas condiciones constantes de pH y nutrientes permitiendo unas condiciones adecuadas para el desarrollo de Salmonella.

Para ello se pesan 25g de alimento e introducen en 225mL de una solución de APT. Se mezcla e incuba a 37ºC durante 16-20h. Para el análisis de superficies, utilizando por ejemplo esponjas abrasivas, se incuba en 125mL de APT. 

Enriquecimiento en medio líquido selectivo

Seguidamente una alícuota del proceso  anterior se utiliza para sembrar en  un  medio

selectivo (dilución 1:10) que  estimula  y  favorece  el  crecimiento  de   Salmonella

inhibiendo  la  flora  acompañante, o bien   realizarse  un  enriquecimiento  sobre  la

muestra alimentaria diluida  en  APT  al  que  se   adiciona   IRIS  Salmonella   como

suplemento   selectivo evitando el primer paso.

Como medios líquidos selectivos para Salmonella se pueden utilizar:

• Caldo selenito- cistina. El selenito  inhibe  gran  parte  de  la  flora intestinal competitiva  y  la  cistina  favorece  el crecimiento de Salmonella, incubando a 37ºC 18-24h.

• Caldo Rappaport- Vassiliadis. El verde de malaquita inhibe la flora acompañante. Los fosfatos mantienen constate el valor de pH durante la incubación y el cloruro magnésico que incrementa la presión osmótica, favorece el desarrollo  de Salmonella. La recuperación óptima se obtiene incubando a 42ºC 18-24h. La aparición de turbidez en el tubo denota la presencia de Salmonella.
• Caldo tetrationato-bilis-verde  brillante  (Müller  Kauffmann).  El  tetrationato  inhibe  el  crecimiento  de coliformes y otras bacterias intestinales. La bilis favorece el crecimiento de Salmonella e impide el desarrollo de la flora competitiva. El verde brillante inhibe las bacterias gram + y el carbonato mantiene constante el pH. Se obtiene una recuperación más favorable a 42ºC 18-24h.

Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo

En esta etapa se estimula el crecimiento selectivo de Salmonella, permitiendo, a través de los diferentes medios, colonias con aspecto característico. Se recomienda hacer un cultivo en placa por duplicado incubando a 37ºC 24-48h..

• Agar verde brillante-rojo fenol (BGA). Colonias de color rosado, transparentes, rodeadas por un halo rojo por no tener metabolismo fermentativo de lactosa.

• Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). Colonias rojas por la fermentación de la xilosa y descarboxilación de la lisina, acompañada de un descenso de pH, cuyo interior se encuentra pigmentado de negro debido a la producción de SH2.  

• Agar Salmonella-Shigella (SS). La preencia de hierro y tiosulfato permiten la formaciñon de FeS, lo que conlleva al ennegrecimiento de las colonias. El verde brillante, sales biliares y citrato inhiben la flora acompañante. La presencia de un halo rojizo alrededor de las colonias es indicativo de coliformes por su carácter fermentativo  frente a la lactosa.

• -Agar Hektoen (HE). Colonias  verde- azuladas,  pudiendo  tener  el  centro  negro.  La  presencia de  sales biliares inhibe la flora competitiva. Este medio posee dos indicadores (azul de bromotimol y fuchina ácida) que permiten la diferenciación de las bacterias lactosa-positiva y lactosa-negativa. El tiosulfato sódico y citrato de hierro permiten la producción de sulfhídrico.

• Agar sulfito bismuto (SB). Colonias negras (SH2 +) con borde claro y rodeadas de un precipitado negro brillante, por la reducción del bismuto. En ocasiones las colonias pueden ser verdes grises o marrones.

• Agar manitol- lisina- cristal  violeta-  verde  brillante  ( MLCB).  El  carácter  fermentativo  sobre  manitol desciende el pH, iniciando la descarboxilación de la lisina, apareciendo coloración negra que, unido a la producción de sulfhídrico muestra colonias grandes de color negro.

• Agar  cromogénico :  Medio  utilizado  para  la  diferenciación  selectiva  de  microorganismos  utilizando sustratos cromogénicos que producen coloración característica para cada microorganismo.

• Agar Compass Salmonella: Sirve para la detección específica de todas las cepas de Salmonella produciendo colonias rojo-magenta tras su incubación a 37ºC 24h.
• Agar IRIS Salmonella: Se procede del mismo modo que para Compass Salmonella, obteniendo colonias magenta.

Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas

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