PRACTICA N° 03 RECUENTO EN PLACA

PRACTICA N° 03

RECUENTO EN PLACA

1. INTRODUCCION:

El método de recuento en placa, permite la determinación de los microorganismos viables presentes en una muestra, siempre que se utilice un medio de cultivo adecuado y que las condiciones de incubación sean correctas (nutrientes, atmosfera y temperatura).

Por lo tanto, este método puede aplicarse al recuento de grupos distintos de microorganismos. Así tenemos microrganismos psicrófilos, mesófilos, termófilos, mohos y levaduras, enterocococos, estafilocococos, enterobacterias, etc.

Las técnicas de siembra más comúnmente usadas para el recuento de microorganismos viables, son el recuento estándar en placa por siembra por incorporación y el recuento en placa de siembra por extensión en superficie. Es necesario indicar, que ninguna de estas formas de siembra es capaz de poner de manifiesto todos los microorganismos viables presentes en una muestra debido a la variedad de necesidades nutritivas y condiciones físicas exigidas por los diferentes tipos de microorganismos, por lo cual el recuento en placa proporciona solo una aproximación de la población total presente en la muestra.

Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, para expresar el resultado se utiliza el termino: “unidades formadoras de colonias” (u.f.c). Además, a fin de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimación del recuento.

Para examinar los materiales solidos que son solubles en el agua o que forman suspensiones finales en este medio (como por ej. Harina, leche en polvo o azúcar), se suspende o se disuelve por agitación en un diluyente estéril una cantidad dada de su muestra. Ciertos materiales solidos como el queso y la carne, deben ser triturados hasta pequeñas partículas en diluyente estéril. Entre los diluyentes más comúnmente empleados se encuentran la solución Ringer diluida a un cuarto, el diluyente agua de peptona y la Solución Salina Fisiológica Peptonada (S.S.F.P).

1.   OBJETIVOS:

1. Adiestrar al estudiante con el método de recuento en placa.
2. Determinar el número de microorganismos viables presentes en una muestra de alimento.

1. MATERIAL:

1. BIOLOGICO:

• Muestra: agua

1. DE LABORATORIO:

• Placas de Petri estériles
• Pipetas.
• Mechero.
• Tubos de ensayo.

1. MEDIOS DE CULTIVO:

• Agar cuenta gérmenes (PCA)
• Solución Salina Fisiológica Peptonada (SSFP)  

1. EQUIPOS:

• Contador Quebeck
• Incubadora regulada a 35 – 37°C

1. PROCEDIMIETO:

La muestra debe llegar al laboratorio convenientemente identificada cumpliendo los requisitos del muestreo.

1. SIEMBRA POR INCORPORACION:

1. Desinfectar el lugar de trabajo con alcohol yodado.
2. Identificar la muestra con los siguientes datos: nombres y/o número de lote, dilución, volumen sembrado, técnica de siembra, fecha, operador, etc.
3. Según la carga microbiana esperada elegir las diluciones a sembrar.

Realizar no menos de tres diluciones consecutivas: 1:10, 1:100, 1:1000.

Cada vez que se prepara una dilución cargar y descargar la pipeta por lo menos tres veces.

1. Depositar un mililitro de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado.
2. Adicionar a cada placa a 20 ml del medio de cultivo a emplear (por ejemplo, PCA, para bacterias aerobias mesófilas viables, u otro medio de cultivo de acuerdo al microorganismo que se desee contar), previamente licuado y enfriado a 45°C.
3. Mezclar cuidadosamente el medio y el inoculo mediante una combinación de movimientos giratorios y de vaivén, sobre la superficie de la mesa de trabajo.  Deben tomarse precauciones para que, durante estos movimientos, el agar no toque la tapa de la placa de Petri. Dejar solidificar.
4.  Después de solidificado el agar, incubar las placas a 37°C durante 24 a 48 horas.
5. Para el recuento, escoger las placas en las que han desarrollado entre 30 y 300 u.f.c.

Para calcular el número de bacteria viables (U.F.C.) por mililitro (ml) o gramo (g) de muestra original, se procede de la siguiente manera:

1. Seleccionar dos placas correspondientes a una disolución que contenga entre 30 y 300.

Ejemplo: dilución 10-2

        Placa 1: 85 UFC

        Placa 2: 89 UFC

Si este fuera el caso sacar la media aritmética de los dos recuentos y multiplicar por el inverso del factor de dilución. Reportar el resultado como numero de u.f.c. por gramo o mililitro según sea el caso.

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