ANÁLISIS DE MÉTODOS USADOS PARA CUANTIFICAR PROTEÍNAS

ANÁLISIS DE MÉTODOS USADOS PARA CUANTIFICAR PROTEÍNAS

Canasto-Jiménez, Natalia;  Mendieta Carreño, Mary Alejandra, Nieto, Maria José

ABSTRACT

There are different methods to quantify the proteins present in a sample, though some of them could be more effective than others, because all of them have  advantages and disadvantages. To quantify the amount of protein present in  bean flour the methods used were Biuret, Lowry and Micro-Kjeldahl. With the information request was possible to make the calculations and the calibration curves to perform and found that concentration in the bean flour; with the Kjeldahl method was achievable determined the percentage of nitrogen and crude protein in the samples of cooked egg and bean flour, with the tryptophan like a pattern. These information were analyzed in order to conclude that of these three methods used the most effective was Biuret

KEY WORDS

Spectrophotometry, amino acids, Lowry, Biuret, Micro-Kjeldahl

RESUMEN

Existen diferentes métodos para cuantificar las proteínas presentes en una muestra a estudiar, sin embargo algunos pueden ser más efectivos que otros, ya que todos tienen ventajas y desventajas. Los métodos utilizados en esta práctica fueron el de Biuret, Lowry y Micro-Kjeldahl para poder cuantificar la cantidad de proteína presente en la harina de frijol, con los resultados experimentales obtenidos se realizaron los respectivos cálculos y las curvas de calibración para poder hallar dicha concentración; con el método de Kjeldahl se pudo determinar el porcentaje nitrógeno y proteína bruta en muestras de huevo y harina de frijol, teniendo como patrón el triptófano. Estos datos se analizaron para así poder llegar a la conclusión que entre estos tres métodos usados el más efectivo fue el de Biuret.

PALABRAS CLAVE

Espectrofotometría, aminoácidos, Lowry, Biuret,  Microkjeldahl

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas constituidas a partir de aminoácidos con múltiples funciones de importancia crucial, como es el caso de el citoesqueleto que es una red de proteína interna que mantiene la forma y la integridad física, los filamentos de actina y miosina que juegan un papel fundamental en la contracción del músculo, la hemoglobina que transporta el oxígeno, anticuerpos que protegen el organismos de agentes extraños,  entre muchas otras. Una proteína típica nace con la traducción, madura a través de eventos de procesamiento postraduccional, alterna entre estados de trabajo y de reposo por medio de la intervención de factores reguladores, envejece por oxidación u otra tipo de  degradación (Harper, 2006).

Para realizar la cuantificación de proteínas existen distintos métodos, muchos de estos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Fernández & Galván, 2011). La cuantificación de proteínas se refiere a la determinación de la cantidad de proteína, relativa o absoluta en gramos o mol en una muestra; la diferencia entre la cuantificación relativa y la absoluta es que en la primera se hace una comparación de la abundancia de una proteína en dos o más muestras, mientras que en la absoluta se determina la abundancia de una proteína específica en una única muestra. Al calcular  la abundancia de una proteína específica se debe tener en cuenta también que esta puede variar enormemente entre sitios y estados (Eidhamme I. et al., 2013).

La reacción de Biuret debe su nombre al biuret, una molécula que se forma a partir de dos moléculas de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), la cual es la molécula más sencilla que da positivo a esta reacción, con la cual es posible calcular la concentración de proteínas en una mezcla. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina por la presencia de NaOH o KOH. La reacción se basa en la formación de un complejo de coordinación color violeta que se da por la reacción entre los iones Cu^2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, la intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos). Esta reacción es bastante específica de manera que pocas sustancias interfieren, sin embargo este procedimiento es útil cuando la concentración de proteína se encuentra en un rango de 1-20 m/mL.

Otro procedimiento utilizado para la cuantificación de proteínas es el método de Lowry, el cual utiliza el reactivo de fenol-Folin Ciocalteu. Para este método es posible ver dos virajes por reacción, en el primero se desarrolla un color de poca intensidad con el cobre en medio alcalino, posteriormente se torna a un tono azul verdoso con el reactivo de Folin, el cual contiene molibdato de sodio y tungstato de sodio en presencia de ácido fosfórico y clorhídrico. Este reactivo es el encargado de reaccionar con los aminoácidos aromáticos, fenilalanina y triptófano de la proteína. Este método permite determinar la concentración de proteína en rangos de 0,01 - 1 mg/mL.

El ensayo de Lowry (1951) es un ensayo de proteínas de uso general que es frecuentemente citado. Durante algún tiempo fue el método de elección para la determinación de proteínas para fracciones celulares, de cromatografía, preparaciones de enzimas, entre otros. Sin embargo el ensayo de ácido bicinconínico (BCA)  se basa en el mismo principio y se puede hacer en un solo paso, por lo tanto, se sugirió (Stoscheck, 1990) que el método de Lowry que consta de dos pasos, es obsoleto. Aún así, el método de Lowry modificado se realiza por completo a temperatura ambiente en la versión de Hartree del ensayo de Lowry, en esta  modificación se utiliza un menor número de reactivos que mejora la sensibilidad con algunas proteínas y hace que sea  menos probable la incompatibilidad con algunas soluciones salinas, también  proporciona una respuesta más lineal, y es menos probable que se convierta en una solución saturada (Winters A & Minchin F, 2005).

Para el método de micro-Kjeldahl la muestra es digerida con ácido sulfúrico y el nitrógeno orgánico se convierte en sulfato de amonio. La solución se alcaliniza y el amonios se destila y es recuperado en una solución de ácido sulfúrico al titularse con una solución de hidróxido de sodio. En este método la determinación total de nitrógeno ha sido estudiada en varias ocasiones y automatizada mediante un equipo (Steyermark and McGee, 1960). Como se mencionó previamente el método tiene un principio en el que las muestras orgánicas son deshidratadas y pirolizadas en condiciones reducidas de alta acidez y temperatura.

Un amplio número de biomoléculas tienen la capacidad de absorber luz a una determinada longitud de onda, para poder calcular la longitud de onda e identificar las moléculas junto con su concentración en una solución, se utiliza un espectrofotómetro. La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda determinada está relacionada con el espesor de la capa absorbente, la longitud de trayectoria, y la concentración de especies absorbentes. Esta relación se combina en la ley de Lambert-Beer que además asume que la luz incidente es paralela y monocromática, también señala         que las moléculas del soluto y del solvente están orientadas al azar. Se describe entonces que cuando hay una capa absorbente fija en la longitud de trayectoria, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente. Por lo que se determina que  coeficiente de extinción varía con la naturaleza del componente de  absorción, el solvente, la longitud de onda y además con el pH ya que si la especie de luz absorbida está en equilibrio con un estado de ionización este tiene unas propiedades diferentes de absorbancia (Lehninger, 2005).

MATERIALES Y METÓDOS

Para los procedimientos de cuantificación de proteínas en los métodos de Biuret y Lowry, se escogió como muestra el aceite de frijol. Dentro de la preparación que requieren ambos métodos, se realizó una extracción o solución problema a partir del aceite. Por lo que en un tubo de ensayo se agregaron 2 g de la muestra con 10 mL de NaCl (cloruro de sodio) al 1%, la mezcla se agitó durante 10 minutos con agitador magnético y se procedió a centrifugar en una centrífuga refrigerada a 2500 r.p.m durante 3 o 5 min. El sobrenadante, se vació en un balón volumétrico de 25mL y se le agregaron 10 mL de NaCl al 1%, se centrifugó de nuevo y se procedió a extraer el residuo como la primera vez. Se reunieron los sobrenadantes en un mismo balón de 25 mL y se llevó al afore con solución NaCl.

A partir del método de Biuret se rotularon 11 tubos en los que cuales se adicionaron los reactivos en un orden determinado, primero el patrón de BSA con concentración de 3,0 mg/mL preparado en solución salina NaCl al 0.9%, segundo el extracto o solución problema, tercero NaCl al 0.9% y por último el reactivo de Biuret. Cada reactivo se adicionó en cantidades (mL) diferentes pero que en total todos tuvieran 6,0 mL. Se dejaron reposar durante 30 minutos, para que se desarrollará el color y posterior a esto, se procedió a leer la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, iniciando la lectura a partir del tubo con menor concentración para obtener resultados más estables y exactos de las lecturas a cada muestra.

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