ANÁLISIS DE UNA NUCLEOPROTEÍNA

Universidad de Panamá

Facultad de Medicina

Escuela de Tecnología Médica

Escuela de Biología

Departamento de Genética y biología molecular

Integrantes:

Marjorie Burke    8-924-303

Mabel Castillo     8-920-2498

Aldo Flores          8-931-1931

Grupo:

1. A

Laboratorio #1

Tema:

Análisis de una Nucleoproteína

Profesora:

Indira Martínez

Fecha:

Viernes, 6 de mayo del 2016

 Introducción

ANÁLISIS DE UNA NUCLEOPROTEÍNA

Las proteínas conjugadas son las que contienen algún grupo prostético o porción no peptídica. En estas proteínas la fracción peptídica se llama apoproteína. El grupo prostético puede tener una naturaleza química muy variada. Macarulla, M. (1994). Bioquímica Humana Barcelona, España: Editorial Reverté.

Las nucleoproteínas contienen, como grupo prostético, ácidos nucleicos (ADN y ARN); son moléculas complejas y con una masa molecular muy grande. El ácido desoxirribonucleico se localiza principalmente en el núcleo de las células, unido a proteínas complejas conocidas como histonas. El ácido ribonucleico está localizado en el núcleo y en el citoplasma. Acuña, F. (2006). Química Orgánica San José, Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia.

El ADN es una doble hélice derecha compuesta de dos cadenas de polinucleotidos enrolladas sobre el mismo eje y entramadas por enlace de hidrógeno entre las bases. Mientras que el ADN duplica la información genética, el ARN la transforma de un código de 4 tipos (A, C, G, U) en otro de 20 (aminoácidos de las proteínas). Griffin, R. (1981). Química Orgánica Moderna Barcelona, España: Editorial Reverté.

Objetivos

1. Extraer una nucleoproteína de células de levadura.

2. Identificar los componentes más sencillos de la nucleoproteína extraída.

Metodología

Parte 1: Extracción de una nucleoproteína a partir de la levadura.

En un mortero colocamos 5 gramos de levadura, le añadimos 10 gotas de éter dietilico, 10 gotas de agua y le agregamos una cucharadita de arena de vidrio. Después trituramos esa mezcla hasta obtener una mas homogenizada. A esa masa le agregamos 30 ml de hidróxido de sodio al 0,4 % y seguimos triturando durante 15 minutos. Lo que obtuvimos lo repartimos en 3 tubos de ensayo con 10 ml en cada tubo para centrifugarlo por 5 a 10 minutos a 3000 r.p.m. Después transferimos el sobrenadante a un vaso químico en el que se vertieron 12 ml de la solución de acido acético al 5%,  luego revolvimos constantemente con la varilla hasta obtener una completa precipitación de la nucleoproteina.

El precipitado obtenido lo separamos mediante otra centrifugación  y la utilizamos para la reacción de la hidrólisis.

Parte #2: Hidrolizar la nucleoproteína.

La nucleoproteina que obtuvimos de la levadura la trasladamos a un matraz para realizar el proceso de hidrólisis y le añadimos 15 ml de acido sulfúrico añ 5%. Cerramos el matraz con el refrigerante de reflujo y lo pusimos a hervir durante 1 hora. Cuando se enfrio el hidrolizado lo filtramos en un vaso químico y luego utilizamos ese filtrado para el análisis de los productos de la hidrólisis.

Parte #3: Identificación de proteínas sencillas.

Prueba de Biuret

Vertimos 0,5 ml del hidrolizado en un tubo de ensayo, después lo neutralizamos con 12 a 15 gotas de hidróxido de sodio al 10 %. Y con el papel de tornasol íbamos probando el pH.

Parte #4: Identificación de las Pentosas.

En un tubo de ensayo vertimos 0,5 ml del hidrolizado y luego  lo neutralizamos con 10 gotas de hidróxido de sodio. Al hidrolizado ya neutralizado le añadimos el reactivo de Fehling con el mismo volumen del hidrolizado. Después agitamos el tubo de ensayo y lo calentamos durante 5 minutos.

Parte #5: Identificación de las bases puricas

Agregamos 2 ml del hridolizado en un tubo de ensayo y le añadimos 5 gotas de amoniaco concentrado hasta que la muestra se torno alcalina. Luego agregamos 0.5 ml de solución de nitrato de plata en amoniaco al 3%.

Parte #6: Identificación del Ácido Fosfórico

Agregamos 2ml de hidrolizado en un tubo de ensayo y después le añadimos 3 ml de molibdato de amonio y 1 ml de acido ascórbico. Lo mesclamos y lo llevamos a baño Maria.

Resultados

Parte 1: Extracción de una nucleoproteína a partir de la levadura.

Cuando colocamos los 5 gramos de lavadura en el mortero, las 10 gotas de éter, agua, la cucharadita de arena de vidrio en el mortero, se trituro cuidadosamente, se observó una mezcla homogenizada en forma de pasta, luego en la primera centrifugación logramos ver que la nucleoproteína quedo en la superficie, y en la segunda centrifugación se observó que la nucleoproteína se precipito.[pic 1]Figura #1: serie de procedimientos realizados para la extracción de la nucleoproteína.

Parte #2: Hidrolizar la nucleoproteína.

Al hidrolizar la nucleoproteína logramos observar como resultado un líquido amarillo como si fuese una especie de aceite y sus componentes: proteínas sencillas del tipo de histonas, protaminas, a veces globulina, albumina conjugadas con ácidos nucleicos.

Parte #3: Identificación de proteínas sencillas.

Prueba de Biuret:Cuando añadimos el hidrolizado al tubo de ensayo para neutralizar el pH  no dio. Por lo tanto hicimos otra muestra, pero igual dio un resultado negativo ya que  nos dio un pH de 6 y no 7.

En cuanto a la prueba de Biuret: Identificación de Proteínas.

Cuando se agregó 5 gotas de NaOH y 3 gotas de CuSO4 se agito; se apreció solidos flotantes y se obtuvo una coloración azul y no violeta por lo que la reacción es negativa.

[pic 2]Figura #2: Observación de la neutralización del hidrolizado y La prueba de Biuret.

Parte #4: Identificación de las Pentosas.

Resulto una reacción negativa ya que la muestra después de un determinado tiempo expuesta al calor dio un precipitado chocolate y no rojo o amarillo. Y en cuanto a la neutralización fue negativa porque dio un pH 3 y no 7.

Parte #5: Identificación de las bases puricas.

Al agregar los 2 ml del hidrolizado al tubo de ensayo, se añadió las 6 gotas de amoniaco concentrado para alcalinizar pero no dio el resultado; por lo que se agregó 5 gotas más dando un total de 11 gotas,  resulto un pH de 8 y no 10 que era lo que se esperaba. También se observó que al añadir amoniaco se liberó calor. Luego cuando se agregó Nitrato de Plata se dio el precipitado blanco en forma de copos aunque no por completo y se obtuvo las sales de plata y las bases puricas.

[pic 3]Figura #3: Solución de Base purica y sus componentes.

Parte #6: Identificación del Ácido Fosfórico.

Cuando agregamos el molibdato de amonio al hidrolizado cambio a un color amarillo, al añadirse ácido ascórbico la temperatura subió, después de 5 minutos tomo un color amarillo verdoso, a los 20 minutos se puso color chocolate esperamos más tiempo pero no logramos observar la coloración azul que nos indica la presencia de fosfatos por lo que deducimos que fue una reacción negativa.

[pic 4]Figura #4: solución Ácido fosfórico.

Discusión

Parte 1: Extracción de una nucleoproteína a partir de la levadura.

En la extracción de la nucleoproteina  el éter mas la arena de vidrio hace que  rompan los enlaces de hidrógeno de las macromoléculas, para la posterior desnaturalización de las proteínas.

En la primera parte de la centrifugación se obtiene en el sobrenadante: carbohidratos y ARN, y en el precipitado: éter, arena de vidrio y DNA que es la parte desechada. En este proceso la proteína no esta completamente desnaturalizada, por lo que se le agrego el acido acético y se agita y se  centrifuga una vez mas para obtener sólo la parte precipitada

Parte #2: Hidrolizar la nucleoproteína.

En la hidrólisis se agrega acido suulfurico y se calienta. estos dos factores comunes de desnaturalización juntos (acido, y calor) nos sirven para determinar que hemos hidrolizado las proteínas.

Parte #3: Identificación de proteínas sencillas.

Prueba de Biuret:

La prueba de de Biuret se da cuando los iones cúpricos son unidos por los enlaces peptídicos a pH alcalino.

En esta prueba nos dio negativa ya que se obtuvo un color azul en vez del color purpura característico de esta reacción.

...