Algunos puntos sobre el control de calidad de los puntos gram

La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).

Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante.

Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realización, a saber:

· Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.

· La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente.

· Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coli, S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados.

· Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram.

· Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.

· Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias.

Metodología

En cuanto al procedimiento técnico en sí, la tinción de Gram consta de:

· Preparación de la extensión: de elección sería utilizar portas mantenidos en un contenedor con alcohol, los cuales se sacan y secan (al aire o por flameado) justo antes de su uso. La extensión debe de rendir una fina monocapa representativa de la muestra:

- Torundas: hacerlas rodar ligeramente sobre el porta para evitar la destrucción de elementos celulares y bacterias. Dejar secar al aire.

- Aspirados, exudados, esputos, heces, ... (muestras sin torundas): seleccionar las partes más purulentas y/o hemáticas, y tras depositar una pequeña fracción (con un asa, torunda, aplicadores estériles…) hacer la extensión con 2 portas:

FIGURA

- LCR y otros líquidos que requieren centrifugación: tras centrifugación (2.500-3.000 rpm durante 15 min.), desechar el sobrenadante y utilizar el sedimento (0,5 ml), homogeneizándolo, verter una gota en un porta y dejar secar al aire. Puede añadirse, opcionalmente, una segunda gota a la primera ya seca para aumentar la sensibilidad.

- Orina: sin centrifugarla, homogeneizar y depositar una gota sobre el porta dejándola secar al aire (se considera que existen > 100.000 UFC/ml orina si se observa > 1 bacteria/campo de alto aumento [x1000] en todos los campos visualizados).

- Muestras muy reducidas: emulsionarlas con 0,5 ml de solución salina estéril, agitar y depositar 1 gota en el porta, extenderla en una capa fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.

- Biopsias: la técnica más utilizada es la extensión por cortado y toques:

FIGURA

- Cultivos líquidos: depositar con pipeta Pasteur o con jeringa-aguja estériles (hemocultivos, cultivos bifásicos de Castañeda…), 1 ó 2 gotas en el porta y hacer una extensión fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.

- Colonias en medio sólido: colocar 1 gota de agua o solución salina (preferible, ya que el agua puede distorsionar la morfología celular de microorganismos frágiles) en un porta, depositar con un asa o aplicador estéril 1 ó 2 colonias, emulsionándolas (no muy vigorosamente por la posible formación de aerosoles) y extendiendo en una fina capa con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.

· Fijación: la extensión puede fijarse con calor o metanol:

- Calor: se realiza sobre superficies calientes (hasta 60ºC) por paso directo de 2 a 3 veces a través de la llama, o por adición de unas gotas de alcohol sobre porta y posterior encendido hasta extinción de la llama. Evitar lo posible el sobrecalentamiento. Esperar a que el porta se enfríe antes de su tinción.

- Metanol: previene la lisis de hematíes y resulta en un más claro fondo. También evita el probable arrastre de la extensión de muestras de orina, semen, líquidos centrifugados … , en la etapa de lavado de la tinción. La técnica consiste en secar la extensión al aire, añadir unas gotas de metanol sobre ésta durante 1 minuto, decantándolo sin lavado y dejando secar la extensión otra vez al aire. No utilizar el calor en ningún momento.

· Tinción: existen varias modificaciones de ésta según reactivos recomendados, tiempos de tinción y usos para la que se destine. Tradicionalmente se han venido aplicando las 3 siguientes:

- Bacteriología en general: se utiliza la modificación de Hucker, la cual utiliza 30 seg. el cristal violeta, 30 seg. la solución iódica de Gram (lugol + bicarbonato sódico diluido), de 1 a 5 seg. la solución decoloradora de alcohol-acetona (1:1), y 30 seg. la safranina o fucsina básica al 0,1-0,2%. A tener en cuenta que los tiempos de decoloración son el paso crítico. Según éstos hay 3 tipos de decoloración:

* Decoloración lenta (30 seg.): Solo con alcohol de 95º. Es la preferida por estudiantes y personal con menos experiencia.

* Decoloración moderada (de 1 a 5 seg.): Es la inicialmente reseñada y, en general, la más recomendada.

* Decoloración rápida (lavar inmediatamente después de aplicarla): Sólo con acetona. Utilizada por personal cualificado y se usa si la muestra contiene gran número de células acompañantes.

- Microorganismos gram (-) de difícil tinción: representados, entre otros, por espécies de Bacteroides, Fusobacterium, Legionella, Campylobacter, Brucella, … . Se le denomina modificación de carbol-fucsina. Básicamente es igual a la modificación de Hucker, excepto que el decolorante recomendado es el etanol 95º (30 seg.) y el contracolorante es carbol-fucsina o la fucsina básica (al 0,8%) aplicándolo durante 1 minuto.

- Anaeróbios: se le denomina modificación de Kopeloff. Los anaerobios con la modificación de Hucker solo se tiñen ligeramente y fácilmente se decoloran. Utiliza los mismos colorantes que los anteriores pero a mayor concentración unos y menor otros, con algunas modificaciones adicionales. El decolorante es alcohol-acetona (7:3) y los tiempos de tinción varían ampliamente con respecto a las 2 modificaciones anteriores.

Interpretación

Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopía tras la realización de la tinción son:

·Como regla para evidenciar una buena decoloración, y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la tinción deberá ser claro o ligeramente gram (-). Si hay leucocitos se observarán completamente gram (-), y si hay levaduras tipo Candida completamente gram (+).

· Para una buena interpretación de la tinción, el grosor de la extensión no debe permitir que aparezcan más de 2 células solapadas unas encima de otras.

· Examinar la tinción en busca de evidencias de inflamación (células polimorfonucleadas, células mononucleadas y/o hematíes). La presencia de células epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios…, según el producto patológico que estemos observando, pueden indicar una mala obtención de éste.

· Inspeccionar distintas áreas de la tinción

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