Amilasa salival práctico

ENFERMERÍA[pic 1]

Actividad Enzimática: Amilasa Salival

Alumnos/as: Carriel Valenzuela, Carolina

González Valdés, Camila

Garrido Barros, Elizabeth

Vielma Rojas, Fabiana

Docente: Flores Aguirre, Susana

Tema: Actividad enzimática

Título del práctico: Actividad enzimática: amilasa salival

Fecha de realización: lunes 24 de agosto

Fecha de entrega: lunes 31 de agosto

ÍNDICE

Índice………………………………………………………………………………………..3

Introducción………………………………………………………………………………..4

Objetivos……………………………………………………………………………………5

Materiales…………………………………………………………………………………..6

Método experimental……………………………………………………………………...7

Cálculos…………………………………………………………………………………….9

Resultados………………………………………………………………………….….....11

Discusión………………………………………………………………………………….13

Conclusión………………………………………………………………………………..15

Cuestionario………………………………………………………………………………16

Referencias……………………………………………………………………………….17

INTRODUCCIÓN

La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y específicos: las enzimas. Prácticamente todas las reacciones bioquímicas son catalizadas por una enzima.

Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las reacciones metabólicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir cambios en su estructura y/o función. La actividad de una enzima depende de diversos factores que alterados, disminuyen, aceleran o terminan la acción enzimática. Los más importantes son la temperatura, el pH, la concentración de sustrato y la presencia o ausencia de inhibidores.

En nuestra saliva encontramos una enzima llamada amilasa salival, que tiene la función de degradar el almidón y algunos azúcares simples que ingerimos al comer. Si no realizamos una correcta masticación de los alimentos en la boca, el almidón de lo que comemos debe ser degradado en el intestino delgado por parte de la amilasa pancreática en maltosa, que luego es degradado por la enzima maltasa dando como producto final la glucosa que es transportada a la sangre y finalmente llevada a las células para proporcionar la energía necesaria para los procesos vitales del organismo.

En el práctico realizado en el laboratorio el día lunes 24 de agosto construimos una curva de calibración con soluciones de almidón al 2%, Lugol y agua destilada, con esto obtuvimos el blanco para ser usado más adelante. Realizamos dos experimentos con la utilización de amilasa salival: el primero consistía en determinar la actividad enzimática de la amilasa salival en condiciones óptimas de temperatura (37°C), para lo que usamos 2 tubos de ensayo con almidón, luego agregamos a uno de los tubos saliva diluida y al otro suero fisiológico, con lo que pudimos observar cómo reacciona la enzima amilasa salival en presencia de almidón determinando la concentración de almidón con la ayuda del espectrofotómetro, que mide la absorbancia de la muestra y con la ecuación antes realizada calculamos la concentración. En el segundo experimento vimos cómo actúa la amilasa a diferentes temperaturas (0°C, temperatura ambiente, 37°C y 90°C), para esto tuvimos que obtener la absorbancia de las muestras mediante el uso del espectrofotómetro y calcular la concentración de las soluciones de los tubos de ensayo con saliva diluida y almidón colocados en sus respectivas temperaturas.

OBJETIVOS

Objetivo general

• Determinar la actividad enzimática de la amilasa salival

Objetivos específicos

• Determinar la absorbancia de las diferentes concentraciones de almidón
• Elaborar la curva de calibración
• Determinar la ecuación de la recta
• Demostrar que la temperatura influye en la acción de la amilasa salival

MATERIALES

Soluciones y reactivos:

• Solución de almidón al 2%
• Lugol
• Solución salina fisiológica (0,9%).
• Agua destilada.
• Saliva humana.

Materiales:

• 1 Gradilla.
• 10 tubos de ensayo.
• 2 Micropipetas (200 y 1000µl)
• 3 vasos de precipitado ( 50 o 100ml)
• Baño de Hielo (0°C).
• Baño termorregulador (90°C).
• Estufa a 37°C
• Cubetas para espectrofotometría
• Espectrofotómetro

MÉTODO EXPERIMENTAL

Metodología:

        Un voluntario de cada grupo junto aproximadamente 5 ml de saliva en un vaso de precipitado pequeño y la diluyo con solución salina fisiológica hasta obtener 15 ml de “solución enzimática”.

        Con los datos de la tabla siguiente, se realizó  la dilución del sustrato,  las lecturas de absorbancia y se construyó la curva de calibración para el  complejo yodo-almidón.

Tabla 1: ordenamiento de datos curva calibración

Se agregó a cada tubo 500 µl de Lugol y luego se completó hasta 5ml con agua destilada.

Experimento 1: Determinación de la Actividad Enzimática

1) Tomamos 2 tubos de ensayo con 3 ml de solución neutra de almidón 2%(p/v). Se colocó el tubo en un baño térmico a 37°C durante por lo menos 2min.

2)  Se mantuvieron los tubos con el almidón (sustrato) a 37°C, luego se le agrego 1 ml de la saliva diluida (enzima) al primer tubo y 1ml de suero fisiológico al segundo tubo.

3) Fueron incubados por 10 min a 37°C.

4) Se les añadió 500 µl de Lugol.

5)  Realizamos  la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.

6)  Determinamos la concentración de almidón en cada tubo.

Experimento 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

1) Tomamos 4 tubos de ensayos. Y se añadimos  a cada uno 1 ml de solución saliva diluida.

2)  Fueron incubados por 5 minutos cada tubo a la temperatura correspondiente:

Tubo1: 0°grados.

Tubo2: Temperatura ambiente.

Tubo3: 37° grados.

Tubo4: 90°grados.

3)  Se agrego a cada tubo 3 ml de solución de almidón 2%, y se mezclo suavemente.

4)  Fueron incubados nuevamente por 10 min a la temperatura correspondiente.

5)  Se añadió 500 µl de Lugol.

6)  Luego realizamos la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.

7)  Determinamos la concentración de almidón en cada tubo.

Con los datos recolectados se construyó la curva de calibración y utilizando esta calculamos las concentraciones de cada ensayo de modo de poder evaluar y comentar la influencia que ejerce el cambio de temperatura en el ensayo.

CÁLCULOS

1.- La ecuación obtenida de la curva de calibración es la siguiente:

Tabla 2: ecuación de curva de calibración

Experimento 1

Tabla 3: cálculo de concentración tubo almidón-saliva diluída

Tabla 4: cálculo de concentración tubo almidón-suero fisiológico

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