Determinación Del Punto Isoelectrico De Un Aminoácido Y Una Proteina

Nombre de la práctica:

Determinación del punto isoeléctrico de un aminoácido y una proteína Práctica

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Fecha de realización:

21/03/ 2014 Fecha de entrega:

11/04/2014 Fecha de revisión:

CONTENIDO Página

I. INTRODUCCIÓN

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

III. OBJETIVO

IV. METODOLOGÍA

IV.1. Material y equipo.

IV.2. Reactivos y soluciones.

IV.3. Preparación de reactivos.

IV.4. Requerimientos de seguridad.

IV.5. Disposición de residuos.

IV.6. Procedimiento.

IV.7. Diseño experimental (si lo hay).

V. RESULTADOS

V.1 Datos experimentales

V.2 Cálculos

VI. DISCUSIÓN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA

I. INTRODUCCIÓN

Definición y clasificación de los aminoácidos.

Un aminoácido es una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Los aminoácidos más frecuentes y de mayor interés son aquellos que forman parte de las proteínas. Dos aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el grupo amino de uno y el carboxilo del otro, liberándose una molécula de agua y formando un enlace amida que se denomina enlace peptídico; estos dos "residuos" de aminoácido forman un dipéptido..

Aminoácidos esenciales:

Aminoácidos que no pueden ser producidos por el organismo y deben provenir de la dieta.

Aminoácidos no esenciales:

Aminoácidos que pueden ser producidos por el organismo mediante otras sustancias.

Clasificación de los aminoácidos.

Aminoácidos esenciales Aminoácidos No esenciales

Histidina Arginina

Isoleucina Acido aspàrtico

Leucina Cisteína

Lisina Acido Glutamico

Metionina Glutamina

Fenilalanina Glicina

Treonina Prolina

Triptófano Serina

Valina Tirosina

Alanina Taurina

(1)

Indicar la estructura química, propiedades químicas, ácido-base y punto isoeléctrico de cada aminoácido.

(2)

Describir la curva de titulación (equivalentes de OH-) de un aminoácido para determinar el punto isoeléctrico y los pKs.

Tal y como se ha descrito previamente, la representación gráfica de la variación del pH de una solución por la adición de equivalentes de ácido o de base se denomina curva de titulación. En el caso de los aminoácidos, las curvas de titulación proporcionan la siguiente información (o bien se puede deducir a partir de las mismas):

- Medida del pK de los grupos ionizables: se localizan en el punto medio de la zona tampón.

- Regiones de capacidad tampón: mesetas donde se localizan los pKs; dichas regiones se encuentran en el intervalo pK ± 1 unidad de pH.

- pI: se localiza en el intervalo de viraje.

- Formas ionizables del aminoácido en cada rango de pH.

- Carga eléctrica del aminoácido en cada rango del pH

- Solubilidad relativa del aminoácido en cada rango de pH

(3)

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS:

¿Cuál es la fórmula del o los aminoácidos a evaluar en esta práctica y qué características físico-químicas tienen?

NOMBRE: Alanina

ácido L-2-aminopropiónico

SÍMBOLOS: Ala; A

NÚMERO CAS: 56-41-7

FAMILIA: aminoácidos con sustituyentes no polares (hidrofóbicos)

FÓRMULA MOLECULAR: C3H7O2N

MASA MOLECULAR: 89 g/mol

PUNTO ISOELÉCTRICO: 6,00

Aminoácido neutro que forma parte del código genético

Aminoácido no esencial que puede ser considerado esencial en ciertas circunstancias

El carbono alfa tiene como sustituyente a un grupo metilo levo-rotatorio, lo cual lo hace uno de los aminoácidos más sencillos en cuanto a estructura molecular (4)

Fig 1: Alanina

NOMBRE: Lisina

Ácido 2,6-diaminohexanoico

SÍMBOLOS: Lis

NÚMERO CAS: 70-54-2

FÓRMULA MOLECULAR: C6H14N2O2

MASA MOLECULAR: 146.19 g/mol

PUNTO ISOELÉCTRICO: 9.74

Como aminoácido esencial, la lisina no se sintetiza en el organismo de los animales y, por consiguiente, éstos deben ingerirlo como lisina o como proteínas que contengan lisina. Existen dos rutas conocidas para la biosíntesis de este aminoácido

Fig 2: Lisina

NOMBRE: Arginina

Ácido 2-amino-5- (diaminometildenoamino) pentanoico

SÍMBOLOS: Arg

NÚMERO CAS: 74-79-3

FÓRMULA MOLECULAR: C6H14N4O2

MASA MOLECULAR: 174.2 g/mol

La arginina o mejor dicho, la estructura L-Arginina es un aminoácido semi-esencial. La arginina está involucrada en numerosos procesos metabólicos y es de vital importancia en el tratamiento de las enfermedades cardíacas y reduce la presión arterial alta. La arginina mejora la circulación sanguínea, fortalece el sistema inmunológico.

Fig 3: Arginina

De acuerdo al aminoácido a evaluar en el equipo: Indicar los pKs y el punto isoeléctrico teórico del aminoácido.

Punto isoeléctrico de Alanina: 6.11

Fig 4: valores de pK para aminoácidos (5)

¿Cómo se determinan experimentalmente los pKs y el pI a partir de una gráfica con datos o valores experimentales? Explicar en base a la ecuación de Henderson-Hasselbalch y el cálculo de mequivalentes OH- .

Los aminoácidos poseen curvas de valoración características, en una representación gráfica del valor de los equivalentes de OH- añadidos contra el valor de pH se pueden obtener dichas curvas de valoración de un ácido monoprótico en cada pk, o pKs de del aminoácido, con ayuda de métodos como la primera derivada, las tangentes o el centro de los círculos se puede determinar el punto medio de los lugares donde la cuerva sufre inflexiones, este punto será un Pk, el promedio de los pK del aminoácido corresponde al pI. (6)

¿Por qué los reactivos para la determinación del punto isoeléctrico deben tener las mismas concentraciones?

Se utilizan las mismas concentraciones con el fin de que exista un equilibrio entre cargas positivas y negativas, es decir, que exista igualdad de cargas eléctricas para que ocurra el llamado punto isoeléctrico a un valor de pH al cual un aminoácido no presenta carga (7)

¿Por qué precipitan las proteínas al llegar al punto isoeléctrico?

Efecto del pH: por lo general las proteínas contienen numerosos grupos ionizables con distintos valores de pK a un pH característico para cada proteína, las cargas positivas de las moléculas equilibran sus cargas negativas, a este pH se le denomina punto isoeléctrico de la proteína, la molécula protéica no tiene carga neta y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico. Por lo tanto en soluciones de concentración salina moderada se espera que la solubilidad de la proteína como función del pH sea mínima en el pI de la proteína y que se incremente alrededor de ese punto con respecto al pH. (8)

¿Cuál es el fundamento de la reacción de titulación que se emplea en esta práctica y qué problemas pueden presentarse en general durante la titulación de proteínas?

La ecuación de Henderson-Hasselbach. Todos los aminoácidos contienen grupos ionizables que actúan como ácidos o bases débiles, donando o ganando protones al modificar el pH. Al igual que todas las reacciones semejantes que siguen la ecuación de Henderson-Hasselbach.(9)

¿Cuál es el punto isoeléctrico teórico de cada una de las caseínas de la leche?

Caseína αs1, 4.1; Caseína αs2, 4.1; Caseína β, 4.5; Caseína κ, 4.1; Caseína γ, 5.8. (10)

Caseína Total de proteínas PM Número de aminoácidos P

¿Cuál es la composición (general y proteica) del suero de la leche a evaluar? Incluir las características generales de la composición proteica del suero de leche

Las proteínas del suero de leche son compactas, globulares, y 1, 000,000 de Daltons, y son solubles en un intervalo de pH muy amplio. Las proteínas constan por lo menos de ocho fracciones diferentes, entre las cuales destacan la β -lactoglobulina, la α-lactoalbúmina, las inmunoglobulinas, β albúmina bovina y las proteasas peptonas. Contiene 4.9% de lactosa, 0.9% de proteína cruda, 0.3% de grasas, 0.2% de aacido láctico y 93.1% de agua. (10)

Después de la práctica:

9. ¿Por qué fue necesario modificar el pH y calentar el suero para observar la formación de un precipitado? Explicar en base a las propiedades fisicoquímicas de las proteínas presentes

Si la coxina se elimina de la leche desnatada por algún método de precipitación, como la adición de ácidos minerales, que da en solución un grupo de

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