Evaluaciòn interna Biologìa Tema: Enzimas

Tema: Enzimas

Pregunta: ¿Cómo influye la temperatura del sustrato en la velocidad de reacción de la enzima (6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa) usando como sustrato hesperidina?

Estudio de la influencia de la temperatura en la velocidad de reacción de la encima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa usando el sustrato hesperidina.

Hipótesis: La temperatura hará que la actividad enzimática sea mayor.

Variables:

Independiente: Enzima (6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa). Los datos dependen completamente en las propiedades de esta enzima.

Dependiente: Absorbancia: depende completamente de la enzima y su actividad enzimática.

Controladas.

• Temperatura
• pH
• cantidad de sustrato, enzima y DNS.
• Tiempo de incubación

Reactivos: (la cantidad es desconocida, el simulador no lo menciona)

• Enzima (6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa)
• Sustrato (Hesperidina)
• DNS (Ácido dinitrosalicílico)

Medidas de seguridad:

Usar la computadora menos de 2h, para evitar fatiga en los ojos, resequedad en los ojos y dolor de cabeza.

• Usar un soporte en la silla para evitar dolores de columna y deformación de esta a un largo plazo.

No presento más métodos de seguridad puesto que es un laboratorio online, que no propone más riegos que una la exposición de luz azul mediante el dispositivo que se use (computadora, Tablet, laptop, etc).

Método.

Se uso un simulador online, el cual era de actividad enzimática  http://biomodel.uah.es/lab/abs/AE/inicio.htm. Donde el simulador poseía sus propios objetivos, que uno de ellos se adapta a uno mío (Encontrar la Temperatura óptima para la enzima). Este permite controlar el pH y la temperatura de la enzima. De lo cual solo se usó la temperatura, y el pH se lo mantuvo en 5 (Weiz, 2018), ya que ese es el pH óptimo de dicha enzima (6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa). Donde luego de incubar la muestra, el simulador permite aplicar DNS (Ácido dinitrosalicílico) para encontrar medir la absorbancia.

Contexto:

La dermatitis varicosa, se debe gracias a la insuficiente venosa, afección prolongada crónica, que provoca problema para retornar la sangre (generalmente) de las piernas hacia el corazón. Esto es ocasionado pues existe un daño en válvulas de las venas. Esto ocasiona que la sangre se acumule en las venas y evita que la sangre fluya adecuadamente. Por lo que la piel empieza a agrietarse y llagarse, causando cambios en la piel. (Este caso, está presente en un integrante en mi familia.)

De esta manera una manera de tratar esta condición, es por medio de un tratamiento de flavonoides en este caso Hesperidina. Ya que esta contiene una amplia gama de actividades como: antioxidante, antiinflamatoria, anti hipercolesterolemia y anticancerígena. Sin embargo, esta tiene a pesar de tener dicha gama, su uso es limitado debido a que contiene una baja solubilidad en fase de aceite y en la fase acuosa le limita su biodisponibilidad que restringe su incorporación en muchas formulaciones. (E.A. GRANADOS LOARCA., 2003)

La hidrolisis enzimática de hesperidina es una manera que permite a esta aumentar la solubilidad, actividad antioxidante y biodisponibilidad. Esta en especial puede ser hidrolizada en 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa. De manera, que esta pueda se pueda usar en los tratamientos. (Padilla, García, Sandoval, 2015)

Objetivos:

1.- El objetivo de este experimento de laboratorio virtual de Biología es analizar cómo influye la temperatura en la velocidad de reacción de la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa con el sustrato hesperidina.

2.- Encontrar la Temperatura óptima para la enzima.

Gracias a estos objetivos, se podrá saber las mejores condiciones para la enzima, que permitirá una mejor aplicación en la hidrolisis de la hesperidina, de manera, que el tratamiento de la dermatitis varicosa sea de mayor calidad. Además, que se sabrá la relación de la temperatura y la velocidad de reacción de la enzima, que mejorar aun más la aplicación de la hidrolisis.

Fundamento teórico.

De manera que se va a analizar una enzima, es esencial tener la comprensión de que es una enzima. Las enzimas en general son catalizadores, que en su mayoría suelen ser proteínas y ciertas son moléculas de ARN (que actúan como enzimas). Estas al ser catalizadores, aumentan la velocidad de una reacción sin consumirse. Lo que permite que reacciones en condiciones extremas (concentración, temperatura o pH), se puedan dar.

En teoría, casi todas las reacciones químicas en los seres vivos son catalizadas. Estas enzimas son específicos de cierta reacción, y comúnmente actúan en un solo sustrato (sustancia que actúa con la enzima). El sustrato como tal, se une a una zoma determinada de la enzima, denominado centro activo. Este centro es el sitio de unión por los aminoácidos en contacto con el sustrato. Y una vez se haya producido el producto, la enzima puede tomar una nueva reacción.

Las enzimas permiten que la energía de activación, que produce la reacción, sea menor de manera que la reacción es espontanea. En la actividad enzimática (la producción de productos a partir de los sustratos), se pueden ver afectados por la temperatura, pH y concentración.  Las enzimas muestran una mejor función en ciertos rangos de pH (por comprobar en el laboratorio), y en condiciones no aptas las enzimas pueden perder su capacidad de unir sustratos. (Khan Academy, 2021)

La actividad se ve afectada por:

• pH: si no está dentro del rango adecuado para la enzima, la actividad se vuelve más lenta. Y un pH muy extremos pueden causar una desnaturalización (cuando empieza a decrecer la energía) de la enzima en sí.
• Concentración de la enzima: Acelera la reacción, al disponer de un sustrato al que unirse. Pero al momento de que sustrato, la aceleración finaliza.
• Concentración del sustrato: Aumenta la velocidad de reacción si hay à más sustrato hasta cierta medida. Una vez se hayan adherido, más sustrato no tendrá efecto, pues la enzima estará en su máxima capacidad.

En esta experimentación se va da uso a la enzima 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa, que es una enzima dilglicosidasa, específica para flavonoides 7-O-rutinosilados. Las diglicosidasas son enzimas que catalizan la hidrolisis en un enlace y liberan como tal disacárido, siendo su única reacción en anglicana.

Y, por otra parte, nos encontramos con el sustrato hesperidina la cual es parte de los faloides, se la puede encontrar en la Citrus X sinesis (naranja). Esta contiene amplia gama de actividades como: antioxidante, antiinflamatoria, anti hipercolesterolemia y anticancerígena. Pero esta tiene a pesar de tener dicha gama, su uso es limitado debido a que contiene una baja solubilidad en fase de aceite y en la fase acuosa le limita su biodisponibilidad que restringe su incorporación en muchas formulaciones. (Padilla, García, Sandoval, 2015)

Y para aumentar la solubilidad, actividad antioxidante y biodisponibilidad, se puede realizar una hidrolisis enzimática. La hidrolisis enzimática es un proceso que acurre a partir de cierto grupo de enzimas hidrolasas. Esto produce una ruptura de enlaces por agua (H20). (Salazar, 2020)

De esta forma para poder analizar la actividad enzimática, se puede usar DNS (Ácido dinitrosalicílico) como referencia para la absorbancia.

La absorbancia, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra. Por lo que se mide con colorímetros o con un espectrómetro. Los valores de la absorbancia se usan para detectar el crecimiento de bacterias en cultivos y para determinar la concentración de moléculas en solución. Este es un método colorimétrico para determinar absorbancias de luz a una longitud de onda de 540 nm. (Porto., Gardey., 2016)

La absorbancia es directamente proporcional, pues a mayor concentración existe mayor número de moléculas y mayor interacción de la luz con ellas. Y esto se puede mostrar mediante la fórmula:

[pic 1]

Según esta fórmula, si una variable (concentración) aumenta la absorbancia también, y asimismo si la absorbancia aumenta la concentración también.  (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, S.f.)

Aun así, si se desea obtener la concentración, se la puede calcular en base a la absorbancia de esta manera: [pic 2]

Donde, A es la absorbancia a una longitud de onda dada [pic 3]. Por ejemplo 540 en el caso del DNS. “a” como la absortividad, o el coeficiente de extinción a dicha onda. “b” como el paso óptico o espesor de la muestra. Y, “c” como la concentración del compuesto que absorbe. (Paysandù, 2020)

Procedimiento:

1. Ya en el simulador mencionado.
2. Desplaza los controles para elegir un pH de 5
3. Desplazarte y seleccionar la temperatura a analizar.
4. Pulsar el botón “añadir” sustrato.  
5. Pulsar el botón “añadir” muestra
6. Se incubará la muestra con la enzima a la temperatura seleccionada (virtualmente por 1 h).
7. Pulsar botón “añadir” DNS
8. Una vez se haya desarrollado el color, pulsa en el espectrofotómetro el botón para medir la absorbancia y anota su valor.
9. Modifica de forma sistemática la temperatura y anota cada valor de absorbancia.
10. Repetir este procedimiento variando la temperatura 11 veces.

Capturas de pantalla de la simulación:

Incubando la muestra con el sustrato.  

[pic 4] 

Muestra luego haber sido aplicada el DNS. 

[pic 5] 

Medición de la absorbancia de la muestra. 

[pic 6] 

En estos gráficos se puede encontrar la representación visual del procedimiento del laboratorio en el simulador.

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