Extracción de RNA total por el método TRIZOL

2. Extracción de RNA total por el método TRIZOL

Introducción.

El ácido ribonucleico (ARN o RNA) es un ácido nucleico formado por una cadena de ribonucleótidos. Está presente tanto en las células procariotas como en las eucariotas. El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma de algunos virus es de doble hebra.

En los organismos celulares desempeña diversas funciones. Es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN para transferir esta información vital durante la síntesis de proteínas.

Varios tipos de ARN regulan la expresión génica, mientras que otros tienen actividad catalítica. El ARN es, pues, mucho más versátil que el ADN.

Toma su nombre del grupo de los azúcares en el esqueleto de la molécula, la ribosa. Los nucleótidos del ARN contienen anillos de ribosa y uracilo, a diferencia del ácido desoxirribonucleico (ADN) que contiene desoxirribosa y timina. Es transcrito desde el ADN por enzimas llamada ARN polimerasas y procesadas por muchas más proteínas. El ARN sirve como una plantilla para la traducción de genes.

Objetivo: Aprender un protocolo de extracción de RNA, así como identificar si las muestras han sido extraídas de manera adecuada.

Fundamento.

El Trizol es un líquido rosa brillante o rosa translucido. El olor del fenol es extremadamente fuerte. Mantiene la integridad de los ácidos nucleicos durante la homogeneización del tejido. Además rompe células y componentes celulares. La homogenización del tejido tiene que hacerse en frio para evitar la degradación del ADN o el ARN, pero una vez añadido el Trizol su degradación se ve seriamente reducida. Los principios activos del Trizol son principalmente fenol (un compuesto volátil tóxico) hidroxiquinoleína, que es un inhibidor de ARNasas, tiocianato de guanidina, tiocianato de aminio y glicerol. De hecho el nombre correcto del protocolo del trizol- cloroformo es método del tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo.

Materiales y equipo

PROCEDIMIENTO[pic 1]

1. En un tubo eppendorf

        Ø 14,000 rpmx 7 min y Decantar

1. Resuspender pellet en 1mL Trizol (vortex)
2. Agregar 200 µL de cloroformo

Mezclar por inversión

Incubar 2 min T.A

Ø12 000 rpm x 7 min

1. Recuperar fase transparente en un tubo nuevo

(cloroformo/RNA)

1. Agregar Isopropol (GM) 500 µL

Mezclar por inversión

Incubar 5 min T.A

Ø 12 000 rpm x 5 min y Decantar

1. Agregar 1 mL Etanol75% (GM)

Mezclar vortex

Incubar 5 min T.A

Ø 14 000 rpm x 7 min y Decantar

1. Resuspender pellet en 25-50 µL H2O-DEPC (NFW)
2. Almacenar -80°C

Resultados

Pureza 260/280 (ratio) 1.71

Contaminación con fenol.

DISCUSIÓN

Para la extracción de RNA usamos un método donde se utiliza TRIZOL sus principios activos son principalmente fenol hidroxiquinoleína, que es un inhibidor de ARNasas, tiocianato de guanidina, tiocianato de aminio y glicerol. Ya que como es de saberse, los protocolos existentes se basan en una rápida inactivación de ARNsas endógenas, muy estables que no requieren de cofactores para funcionar. De esta forma el TRIzol mantiene la integridad de los ácidos nucleicos durante la homogeneización del tejido, por lo que es muy importante.(2)

...