Metodos De Analisis Clinicos

METODOS DIRECTOS

Se deben emplear para:

1. identificar Un virus como agente infeccioso (aislamiento viral). La base del diagnóstico viral es la detección del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la técnica standard de oro sobre la cual se medían todas las otras pruebas de diagnóstico viral, pero hoy en día con el desarrollo de las nuevas técnicas de Biología Molecular ya no es la más sensible. El especialista pide la realización del aislamiento viral pero el proceso suele ser lento, ya que demanda días a semanas para la identificación, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atención del paciente. Además, es un proceso laborioso y caro.

Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.

Líneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen.

Líneas Celulares Continuas: Permite un número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas:

Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de células idénticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario.

Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios.

Libre de contaminación con agentes extraños.

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanálisis (EIA), Test de Aglutinación.

iNMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID).

Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares.

El test de aglutinación

ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces (el más importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápida y barata. También se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.

3.La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).

DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA SINTETICA

Es un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos. Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída, de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa.

La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados

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