ORGANIZACION SUBCELULAR

INTRODUCCIÓN.

Para que una célula, tanto eucarionte como procarionte, pueda funcionar correctamente debe llevar a cabo variados tipos de reacciones químicas, las cuales muchas veces son completamente incompatibles entre sí debido a su naturaleza química, lo que podría conducir a un caos químico (I).

Esto fue causal de que como estrategia evolutiva la célula se compartimentarizara para tener un mejor manejo de estas reacciones y poder funcionar de manera más efectiva.

Esta compartimentarización está regida por los orgánulos celulares los cuales esperamos encontrar y separar en este Practico de laboratorio mediante el uso de marcadores (tales como el Azul de tripán, entre otros) y del método de “Fraccionamiento celular”, lo cual corresponde a un conjunto de técnicas usadas en la mayoría de los laboratorios de hoy en día (II), que permite el estudio los orgánulos celulares mediante su aislamiento en base a su densidad y peso.

MATERIALES Y MÉTODOS.

La primera actividad realizada es el homogeneizado del hígado de pollo utilizado para este experimento. Para este proceso es necesario cortar en trozos pequeños éste hígado teniendo una cuidadosa manipulación con pinzas y tijeras. Luego, estos trozos son colocados en un vaso precipitado donde se procede a realizar el homogeneizado, para esto tenemos un homogeneizador mecánico. Una vez que el de hígado este molido, se vierte en un embudo cubierto de gasa para una mayor filtración y finalmente nuestro homogeneizado está listo.

Una fracción del homogeneizado es puesto en un tubo de centrifuga cónico graduado previamente puesto en hielo, el cual colocamos en la centrifuga durante diez minutos a 2.500 RPM. Tomamos también cuatro tubos de ensayos; uno con agua, succinato y azul de metileno (blanco), y los tres restantes con succinato y azul de metileno. Luego del tiempo transcurrido, tomamos nuestro tubo, y con una pipeta extrajimos el sobrenadante, dejándolo en otro tubo que estuvo reposando en hielo y el pellet obtenido fue suspendido una y otra vez con una pipeta para luego proceder al segundo centrifugado que corresponde a veinte minutos a 6000 RPM. Le agregamos una solución de NaCl 0,9% al sobrenadante, del cual se tomó con un gotario una pequeña fracción de esta solución, se vertió una gota de este contenido sobre un portaobjetos que luego fue cubierto por un cubreobjetos para llevarlo a observar bajo el microscopio a un aumento de 40x y así poder tomar muestras fotográficas de lo visto. Luego procedimos a extraer otra pequeña muestra similar pero esta fue teñida con el marcador azul de Tripán, esta fue sometida al mismo procedimiento anterior bajo el microscopio.

Transcurridos los veinte minutos del centrifugado, retiramos nuestro tubo y procedemos nuevamente a succionar con la pipeta el segundo sobrenadante para colocarlo en otro tubo. El segundo Pellet tuvo el mismo tratamiento que el primero. En los tubos de ensayo rotulados con un marcador que contenían succinato y azul de metileno, se le agrego una muestra de Pellet 1, una muestra de Pellet 2 y una muestra de sobrenadante 2 por separado en cada tubo. Recordemos que también tenemos nuestro tubo con agua, succinato y azul de metileno el cual funcionara como “Blanco”. Entonces, a éstos cuatro tubos se les agregó vaselina para que las muestras no reaccionen con el oxigeno del ambiente y así observar con claridad los resultados esperados, finalmente son posados en el baño termorregulado alrededor de cinco minutos sobre una gradilla para luego poder observar los cambios en las muestras.

OBJETIVO

• Poseer estudio de los orgánulos que contienen las células, para luego poder identificarlos en el experimento.

• Aplicar los conocimientos adquiridos de la centrifugación y el fraccionamiento subcelular para la observación de estos componentes de la célula.

• Reconocer los componentes que se observan luego del proceso de centrifugación.

RESULTADOS.

 Fraccionamiento subcelular de muestra de hígado.

 Experimento 1: Preparación de homogeneizado filtrado de hígado y su posterior proceso de centrifugación para la obtención de pellet y sobrenadante para lograr realizar los experimentos posteriores.

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 Experimento 2: Observación de muestra de pellet 1 obtenido de la primera centrifugación (10’) al microscopio a 40x.

 Observación de Pellet 1. A

 Observación de Pellet 1 con marcador azul de tripán.

 Experimento 3: observación de tubos con diferentes soluciones para lograr examinar su reacción de decoloración del azul de metileno.

N° TUBO Contenido Reacción

1 Blanco 1 ml de succinato + azul de metileno

+ 1ml de agua destilada. No ocurre una reacción.

2 Fracción nuclear 1 ml de succinato + azul de metileno

+ 1 ml de pellet 1. Se logra observar que la muestra

se torna de un color verdoso.

3 Fracción

mitocondrial 1 ml de succinato + azul de metileno

+ 1ml de pellet 2. Se aprecia en la muestra un color celeste

más oscuro en comparación con el

tubo blanco.

4 Fracción

microsomal 1 ml

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