Organizacion Subcelular

Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Biología Celular BIO 035

Trabajo Práctico N° 5:

Organización Subcelular

Introducción

La célula es la unidad básica compatible con la vida, de ella podemos clasificarla como procariontes y eucariontes, no obstante esta terminología a grandes rasgos no son suficientes para comprender su estructura, organización y funcionamiento. Hace 300 años aproximadamente mediante un microscopio fue observado y definido por primara vez la terminología “célula” al observar las celdillas de un corcho, luego con el paso de los años y junto con la modernización del microscopio se empezó a visualizar componentes subcélulares llamados orgánelos (estructuras que se encuentran en el interior de la célula delimitada por una o dos membranas). Actualmente se conocen el núcleo, presente de forma definida con una membrana solo en células eucariontes encargado contener el material genético; Mitocondrias formados por una doble membrana, su función es generar energía; Retículo endoplasmaticos son una red de tubos o sacos aplanados que se encuentra pegado al núcleo su función varía dependiendo de la asociación a ribosomas (RER) este complejo es el encargado a la síntesis de proteína y el REL que se encuentra más distal al núcleo es el encargado de la síntesis de lípidos; los Cloroplastos de encuentra formado por una doble membrana y está presente solo en células vegetales , su función es en la participación de la fotosíntesis ya que contiene clorofila; Ribosomas, formados por dos subunidades (una mayor y otra menor) que contienen proteínas asociadas a ARN, este organelo se puede encontrar en el RE o libres en el citoplasma (contenido principalmente por agua que se encuentra en el interior de la célula); el citoesqueleto es otro organelo que está formado por variados tipos de proteínas que polimerizan estructuras filamentosas encargadas, según su tipo, en la rigidez, movimiento y división celular; aparato de golgi formado por membranas apiladas una sobre otras, es el encargado, principalmente, en la distribución de lípidos y proteínas que ya fueron sintetizadas en el RE; Lisosomas que son vesículas encargadas de la digestión celular y los peroxisomas, vesículas encargadas de la detoxificación celular.

Para obtener este tipo de clasificaciones se puede utilizar el “fraccionamiento celular” que básicamente consiste en visualizar o separar los componentes subcélulares (orgánelos) uno de los métodos utilizados es el centrifugado. Lo principal en este método es obtener una muestra que contenga células que serán procesadas para obtener en tubos que fueron sometidos a centrifugación y debido a las diferencias de tamaños y densidad de componentes a una cierta cantidad de RPM (revoluciones por minutos) se obtendrá un Pellet y un sobrenadante, en el pellet estarán los primeros orgánelos que debido a la fuerza de gravedad caerán al fondo y en el sobrenadante estarán aquellos que no “decantaron”, este sobrenadante se puede volver a someter a centrifugación para obtener otro pellet y otro sobrenadante que posteriormente puede volver a ocuparse. ¿Pero bastará solo con este procedimiento para distinguir estos orgánelos?. A simple vista en un microscopio debido a su estructura puede no distinguirse un organelo de otro y para ello se utilizan marcadores que es un método que ocupa la tinción para mejorar los contrastes (color) de imagen en el microscopio que reacciona con alguna estructura celular debido a su composición química, un ejemplo de ello es el azul de metileno que hace más visible el núcleo de las células.

Objetivos

• Conocer e identificar las etapas de Fraccionamiento Subcelular.

• Identificar organelos presentes en muestras de homogenización

Materiales y métodos

En un comienzo del práctico, la persona a cargo del laboratorio entrega un primer homogenizado que fue preparado con el corte de pequeños trozos de hígado de pollo y depositado en un vaso precipitado con una cantidad suficiente de solución NaCl, luego se trituraron los trozos con una maquina homogeneizadora de laboratorio, a continuación se vació el contenido en una gasa que estaba sobre un embudo (filtración) para hacer pasar aquellos componentes más pequeños (organelos). Este líquido se llama homogeneizado filtrado. Está muestra es depositada en un tubo falcón rotulado como Pellet 1, fue insertado en una centrifuga de laboratorio y expuesto a 2500 rpm (revoluciones por minuto) durate 10 minutos, luego en el tubo falcon se distinguen dos soluciones, una al fondo (pellet) que será resuspendido con 1 ml de NaCl y el sobrenadante, este ultimo es sacado cuidadosamente con un gotario y puesto en otro tubo falcon rotulado como Pellet 2, este sobrenadante ahora es expuesto a 6000 rpm por 20 minutos, al termino nuevamente se distinguirán 2 soluciones, al fondo (pellet) y un sobrenadante 2 que será retirado con otro gotario y depositado en otro tubo falcon rotulado como “sobrenadante 2”. El pellet 2 será resuspendido con 1 ml de NaCl. Los tres tubos falcon con muestras de pellet 1, pellet 2 y sobrenadante 2 serán dejados sobre hielo. Posteriormente del pellet 1 se tomará 1 ml con un gotario limpio y se depositará sobre un portaobjeto y cubierto con un cubreobjeto, esta muestra será vista en el microscopio en 40x, seguidamente en otro porta objeto será depositado 1ml de pellet 1 y 1 ml de azul de tripán, después de colocado el cubreobjeto será mirado en el microscopio en 40x. Finalizado el primer experimento se tomarán 4 tubos de ensayo que durante un tiempo prolongado fueron colocados sobre hielo serán rotulados cada uno y por separado como Blanco(1), Fracción Nuclear(2), Fracción Mitocondrial(3), y Fracción microsomal(4), a todos los tubos se le agregará 1 ml de succinato deshidrogenasa 0,1 M, 1 ml de azul de metileno y 1 ml de agua destilada , luego por separado al tubo 2 se le agregará el pellet 1 obtenido en el primer experimento e inmediatamente 2ml de vaselina, al tubo 2 se le agregará el pellet2 y 2 ml de vaselina, posteriormente al tubo 3 se le agregara el sobrenadante 2 y 2 ml de vaselina,

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