PRÁCTICA BIOQUÍMICA.
Enviado por quique36ful . • 3 de Octubre de 2016 • Tareas • 677 Palabras (3 Páginas) • 344 Visitas
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Introducción
Para la determinación del residuo aminoácido N-terminal se requiere su marcado específico con compuestos que se unen covalentemente a los grupos NH2. Sanger introdujo el uso del 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB o reactivo de Sanger) que reacciona selectivamente con los grupos NH2 de un polipéptido.El DNFB, reactivo de color amarillo, reacciona con los grupos amino libres en condiciones ligeramente alcalinas formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa) también color amarillo. Cuando un péptido o una proteína, después de reaccionar con el reactivo de Sanger, se hidroliza con HCl 6 N aplicando temperatura y presión, todos los enlaces peptídicos se rompen, sin embargo, la unión entre dinitrofenilo y el amino permanece estable y por lo tanto va contener aminoácidos libres y derivados de dinitrofenil , estos pueden extraerse del hidrolizado con éter e identificarse por medio de cromatografía en papel.
Objetivos
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger.
Resultados
Tabla 1. Interpretación y análisis en la preparación del derivado de dinitrofenilado.
Reactivo | Función |
Hemoglobina humana | Solucion a determinar el grupo amino terminal. |
Bicarbonato de sodio al 4.2% | Desprotonar el grupo amino-terminar |
Alcohol | Eliminar residuos de eter |
DNFB | Marcador del grupo amino-terminal |
FeSO4 al 0.6% | Nos va dar estabilidad al tubo ya que los superoxidos no reaccionan con el medio. |
Éter | Nos va separa la fase acuosa de la fase orgánica |
HCl 3 N | Nos va proporcionar un medio acido |
HCl 6 N | Nos va inducir una hidrolisis acida. |
Ac. Cítrico y citrato de sodio | Solvente de saturación |
Derivados de Val, Asp y Phe | Aminoácidos puros de referencia para comparar |
Amoniaco concentrado | Sirve de relevador para intensificar el color amarillo de los derivados dinitrofenilados |
Éter saturado con FeSO4 | Evita la proyección del éter y la separación de la fase acuosa de la fase orgánica. |
Alcohol | Eliminar los residuos de eter |
Fig. 1 Cromatografía en papel (de izquierda a derecha) DNFB, DNP-Phe, DNP-Val, DNP-Ala, sustancia problema.
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Cálculo de Rf
Frente del disolvente: 37 cm
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Tabla 2. Resultados de Rf de la cromatografía.
Soluciones | Distancia de la muestra desde el origen (cm) | Rf |
DNFB | 16.5 | 0.4459 |
Phe | 21 | 0.5675 |
Val | 25 | 0.6756 |
Ala | 21.58 | 0.5810 |
Problema 1 Mancha | 15.3 | 0.4135 |
Problema2 Mancha | 25.5 | 0.6891 |
Discusión de resultados
El método de Sanger fue aplicado para identificar al grupo α amino terminal, utilizando el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, para formar derivados DNP con el grupo amino terminal cuidando que no cortáramos los enlaces peptídicos, al hidrolizarla con ácido y en condiciones extremas logramos romper dichos enlaces para que obtuviéramos al grupo amino terminal marcado con el reactivo de Sanger y así separarlo mediante la cromatografía en papel.
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