Práctica de aminoacidos

PRÁCTICA  1

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

        La cromatografía es una técnica que se utiliza ordinariamente para separar una serie de solutos disueltos en un disolvente común, utilizando uno o más de los siguientes fenómenos: adsorción diferencial, partición líquido-líquido o intercambio iónico. Las variantes más comunes empleadas para este fin, son la cromatografía en columna, cromatografía en papel y cromatografía por intercambio iónico.

        La cromatografía en papel es una técnica muy sencilla basada en la adsorción diferencial y la partición líquido-líquido, este último fenómeno se refiere al hecho que una sustancia (soluto) puede exhibir diferentes grados de solubilidad en 2 o más disolvente. Usualmente, en una pieza de papel filtro se aplican puntos (gotas) de una solución acuosa con la mezcla de compuestos, cerca del borde de uno de los dos márgenes libres; se engrapan los bordes libres para formar un cilindro y se coloca en una cámara saturada con el vapor de un segundo disolvente  (orgánico). El fondo de la cámara contiene una cantidad de disolvente el cual migra a través del papel por capilaridad, se cierra la cámara y se deja que la cromatografía proceda hasta que el disolvente  alcanza el tope del papel. Si las muestras no son coloreadas, después de la cromatografía se revelan haciéndolas reaccionar con un reactivo específico.

        Las moléculas pueden caracterizarse midiendo la distancia de migración del disolvente y la distancia de migración de una fracción determinada, si la relación de tales distancias se procesa como distancia del soluto/distancia del disolvente, se conoce el valor de Rf para esa sustancia; si las condiciones se mantienen constantes, este valor es reproducible y puede utilizarse para caracterizar una molécula. El valor de Rf variará de acuerdo al disolvente o mezcla de disolventes, la temperatura y la naturaleza del papel que sean utilizados. Esta técnica puede practicarse haciendo que el disolvente ascienda o descienda a través del papel denominándose respectivamente, cromatografía ascendente o descendente.

OBJETIVOS

- Comparar las propiedades de solubilidad de los diferentes aminoácidos mediante su separación por cromatografía en papel.

- Separar e identificar los aminoácidos presentes en un extracto hidrolizado de células vegetales, por medio de la cromatografía en papel.

MÉTODO

A) Extracción de aminoácidos totales de un extracto crudo.

1. Pese 1g de tejido (hojas) y colóquelo en el mortero con 6 ml de una mezcla de metanol-cloroformo-agua (MCA) en proporción 12:5:3 v/v y macere, si se evapora el solvente agregue otros 6 ml.

1. Centrifugue el macerado a 3 000 rpm, durante 5 minutos.

1. Separe el sobrenadante en un tubo de ensayo y agregue a la pastilla otros 3 ml de metanol-cloroformo-agua (MCA) 12:5:3 v/v, agite.

1. Centrifugue nuevamente a 3 000 rpm, durante 5 minutos.

1. Mezcle el sobrenadante con el que obtuvo en el paso 4 y deseche la pastilla.

1. A los sobrenadantes  reunidos, agrégueles 3 ml de cloroformo y 4.5 ml de agua destilada.

1. Centrifugue a 3 000 rpm, durante 5 minutos.

1. Recupere la fase acuosa (superior) y descarte la fase clorofórmica (inferior).

1. Guarde la fase acuosa recuperada para la cromatografía y para la cuantificación de aminoácidos de la práctica 2.

B) Separación del patrón de aminoácidos y muestra problema por cromatografía en papel.

1. En una hoja de papel Whatman No. 1, trace con un lápiz una línea recta a 2 cm del borde inferior que estará en contacto con el eluyente. Recuerde manipular el papel usando siempre guantes de látex o siliconizados para evitar contaminarlo.

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