Seminario 2

Separando Organelos

En los años ’50 y ’60, los científicos usaban dos técnicas para estudiar los organelos celulares: microscopía y fraccionamiento. Christian de Duve era pionero en el método de fraccionamiento celular. A inicios de la década del ’50, usó la centrifugación para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, de otras fracciones celulares previamente caracterizadas: el núcleo, la fracción mitocondrial y los microsomas. Pronto después de eso utilizó la centrifugación de equilibro-densidad para descubrir otro organelo.

ANTECEDENTES

Las células eucariontes están altamente organizadas y compuestas de estructuras celulares conocidas como organelos, los que llevan a cabo funciones específicas. Si bien la microscopía permitió que los biólogos describieran la localización y apariencia de varios organelos, este método tiene un uso limitado al tratarse de descubrir las funciones que cumplen los organelos. Para lograr esto, los biólogos celulares usaron una técnica conocida como fraccionamiento celular. Con esto, la célula se abre y los componentes celulares se separan según criterios de tamaño, masa y densidad usando variadas técnicas de centrifugación. Los científicos pueden entonces aislar y analizar componentes celulares de diferentes densidades, llamadas fracciones. Usando este método, los biólogos dividieron la célula en cuatro fracciones: núcleo, fracción mitocondrial, microsomas y liquido celular.

de Duve era un bioquímico interesado en la ubicación subcelular de las enzimas metabólicas. Ya había completado una larga línea de trabajo en el fraccionamiento de células hepáticas, en las cuales determinó la ubicación subcelular de numerosas enzimas. Mediante la localización de estas enzimas en fracciones celulares específicas, comenzó a esclarecer la función de los organelos. Se dio cuenta que su trabajo se guiaba por dos hipótesis: el “postulado de homogeneidad bioquímica” y el “postulado de ubicación única”. En pocas palabras, estas hipótesis proponían que todos los compuestos subcelulares debían contener las mismas enzimas, y que cada enzima se localizaba en un lugar reservado dentro de la célula.

Teniendo ya estas hipótesis, y una poderosa herramienta de centrifugación, de Duve además subdividió la fracción mitocondrial. Primero identificó una fracción mitocondrial liviana, compuesta por enzimas hidrolíticas, las cuales ahora se sabe que componen los lisosomas. Luego, en una serie de experimentos aquí descritos, identificó otra discreta fracción subcelular dentro de la fracción mitocondrial, la cual él llamó perixisoma.

EL EXPERIMENTO

de Duve estudió la distribución de las enzimas en células hepáticas de ratas. Altamente activo en energía metabólica, el hígado contiene un buen número de enzimas útiles en el estudio. Para buscar la presencia de varias enzimas durante el fraccionamiento, se basó en estudios conocidos de la actividad de las enzimas, llamados ensayos enzimáticos. Para conservar la máxima actividad enzimática, tuvo que tomar precauciones, que incluyeron realizar todos los pasos del fraccionamiento a 0°C porque el calor denatura las proteínas y la actividad enzimática se hubiera visto afectada.

de Duve usó la centrifugación por gradientes de densidad para separar los componentes celulares por medio de pasos de centrifugación sucesivos. Removió el hígado de las ratas y lo separó por homogenización. La preparación en crudo de células homogenizadas fue sometida a centrifugación relativamente lenta. Este paso inicial separó el núcleo celular, que quedó como sedimento en el fondo del tubo, del extracto citoplasmático que quedó en la parte superior. Después, de Duve además separó el extracto citoplasmático en fracciones mitocondriales pesadas, fracciones mitocondriales livianas y fracciones

...