TERCER CURSO DEL GRADO EN BIOLOGIA.

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 REGULACION DE LA SEÑALIZACION CELULAR

PROTOCOLOS DE CLASES PRACTICAS

TERCER CURSO DEL GRADO EN BIOLOGIA

CURSO 2014-2015

INTRODUCCION

La señalización celular comprende un complejo conjunto de rutas cuya actividad regula y mantiene el funcionamiento celular, y cuya desregulación está implicada y/o es responsable de buen número de patologías humanas. El elevado nivel de conservación filogenética de gran parte de las rutas de señalización hace que su estudio en sistemas celulares y animales sea una potente herramienta que nos ayude a identificar y caracterizar los intermediarios moleculares, las interacciones y los procesos que transducen de manera recíproca las señales entre el medio extracelular y el interior celular.

En los últimos años se han desarrollado gran número de herramientas genéticas, moleculares y celulares que han desembocado en un avance sin precedentes en nuestra capacidad para entender, diagnosticar, prevenir y tratar la enfermedad. Gran parte de este avance es consecuencia directa de nuestra mejor comprensión de los mecanismos por los que la célula responde al entorno extra e intracelular. Junto a metodologías más clásicas de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, se dispone en estos momentos de una batería creciente de nuevas técnicas de Genómica, Proteómica, Metabolómica, Secretómica, Lipidómica y otras, que se espera contribuyan decisivamente a un tratamiento más específico y personalizado de la enfermedad humana. Son particularmente relevantes los nuevos métodos de secuenciación masiva de alto rendimiento, de análisis global de la expresión génica, de producción de modelos animales modificados genéticamente, de elaboración y screening de bases de datos a nivel genómico,

El objetivo principal de estas clases de laboratorio es mostrar, desde el punto de vista práctico y dentro de los recursos disponibles, algunas de las técnicas y protocolos experimentales que, ya sea por su frecuente aplicación en investigación y/o diagnóstico, ya sea por su valor conceptual, se consideran de interés. Estas clases prácticas incluyen la manipulación de cultivos celulares, la realización de ensayos de viabilidad y de muerte celular, el análisis de la migración celular, el aislamiento de DNA genómico y el genotipado por PCR y el estudio de cambios en los niveles de expresión génica por Western immunoblotting.

Las clases de laboratorio implicarán la realización de 4 protocolos experimentales y tendrán una duración de 20 h divididas en 5 sesiones de tarde. Dada esta limitación temporal, será preciso solapar la realización de dichos protocolos, lo que no supondrá, en ningún caso, comprometer el aprendizaje por parte del alumno.

La organización diaria de las tareas correspondientes a cada práctica se detalla en la tabla que se incluye al final del guión.

PRACTICA 1: GENOTIPADO DE DNA GENOMICO DE RATON

En esta práctica se llevará a cabo el aislamiento y la purificación de DNA genómico de cola de ratón por digestión proteolítica. El DNA genómico purificado será empleado para determinar el genotipo respecto al receptor de dioxina (AhR) de ratones silvestres de la cepa C57BL/6N (wt) y de ratones knock-out (KO) generados por recombinación homóloga en células embrionarias (Fernández-Salguero et al. Science, 1995; Santiago-Josefat et al., J. Mol. Biol. 2004).

1. Biopsias de las colas de ratón

• Seccionar una biopsia del extremo de la cola de longitud inferior a 1 cm y transferirlas de inmediato a un tubo eppendorf conteniendo 0.5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl pH 8.5 100 mM, EDTA 5 mM, SDS 0.2%, NaCl 200 mM, 100 mg/ml proteinasa K).
• Digerir toda la noche a 50ºC con agitación. Homogeneizar la digestión con vórtex. Centrifugar a 15.000 rpm (16.000 x g) durante 10 min a 4ºC.
• Retirar el sobrenadante con cuidado, procurando no arrastrar el precipitado que contiene material sin digerir. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio conteniendo 0.5 ml de 2-propanol. Invertir el tubo repetidamente hasta que aparezca el precipitado de DNA genómico.
• Recuperar el DNA con una punta de pipeta y transferirlo a un tubo nuevo conteniendo 80% de etanol. Lavar por inversión, centrifugar a 15.000 rpm durante 30 s a 4ºC.
• Retirar el etanol. Dejar secar el DNA a RT y disolver en 150-200 μl de tampón TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM) toda la noche a 50ºC.

1. Reacción de PCR (polymerase chain reaction)

• Teniendo en cuenta la técnica de clonaje empleada para producir estos animales transgénicos y el método de genotipado diseñado, el alelo silvestre de AhR amplifica por PCR un fragmento de 500 bp mientras que el alelo mutante, en el que se insertó un fragmento de DNA de 1 Kbp origina un producto de PCR de 1.5 Kbp.
• Preparar la reacción de amplificación por PCR en un volumen final de 50 μl de una mezcla de reacción  que contiene: 25 μl de mezcla de reacción para PCR (incluye tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP y la enzima DreamTaq DNA polimerasa), 1 μl de DNA genómico aislado de las colas, 1 μl (50 pmoles) de oligonucleótido cebador específico WT2 (forward): 5´ GGCTAGCGTGCGGGTTTCTC 3´ y 1 μl (50 pmoles) del cebador WT5 (reverse): 5´ CTAGAACGGCACTAGGTAGGTCAG 3´; el volumen restante se completa con agua estéril.
• Llevar a cabo la amplificación en un equipo MJ Reaserch PT100 empleando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95ºC durante 3 min y 30 ciclos desnaturalizando a 95ºC durante 1  min, hibridando a 56ºC durante 1 minuto y extendiendo la síntesis a 72ºC durante 3 min. Tras la reacción, las muestras se mantienen a 4ºC en el equipo.

1. Análisis de los fragmentos de PCR por electroforesis en geles de agarosa.

• Los fragmentos amplificados por PCR se analizarán en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio (EtBr)
• Preparar 150 ml de tampón TBE 1x (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8.3) a partir de un stock 5x. Disolver en dicho tampón la cantidad necesaria de agarosa para que su concentración sea del 0.8% (p/v). Cuando se haya enfriado lo suficiente añadir 5 μl de EtBr 100mg/ml. Depositar el gel líquido en la bandeja de polimerización conteniendo un peine  de 15 pocillos.
• Tomar 25 μl de la reacción de PCR y mezclarlos con 4 μl de tampón de carga para DNA (azul de bromofenol 0.25% (p/v), azul de xileno 0.25% (p/v), glicerol 30% (v/v)). Cargar 30 μl de cada muestra en cada uno de los pocillos del gel de agarosa. Cargar en uno de los pocillos 10 μl de 1 Kbp DNA ladder.
• Desarrollar la electroforesis a 80 V durante 1 h 30 min. Visualizar y fotografiar en un transiluminador UV a 254 nm.

PRACTICA 2: WESTERN IMMUNOBLOTTING

Analizaremos en esta práctica cómo una disminución en la capacidad proliferativa de las células está asociada a una disminución en el nivel de expresión de la proteína PCNA (Proliferating-cell nuclear antigen), la cual tiene un papel relevante en la regulación de la transición G1/S del ciclo celular. Se empleará la línea celular inmortalizada a partir de epitelio murino NMuMG. Estas células serán analizadas en condiciones de proliferación activa, tras alcanzar confluencia y tras ser deprivadas de suero. Con ellos podremos ver si aquellas condiciones que inhiben proliferación implican cambios en los niveles de PCNA.

1. Cultivo de células y obtención de extractos

• Las células NMuMG se cultivan en esterilidad en medio completo (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (v/v), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml 37°C y en atmósfera al 5% de CO2). Se establecen cultivos por triplicado: una placa se procesa cuando alcanza el 60-70% de confluencia; otra se retira al 100% de confluencia y la tercera se depriva de suero (FBS, fetal bovine serum) durante 24 h cuando alcanza el 70% de confluencia.
• Concluidos los tratamientos, se aspira el medio de cultivo y las placas se lavan con tampón PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.5 mM, pH 7.2).
• Las células se lisan durante 10 min a 4ºC con 0.5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, sacarosa 270 mM, β-glicerol-fostato 10 mM, pirofosfato sódico 5 mM, fluoruro sódico 50 mM, Tritón X-100 1% (v/v), ortovanadato sódico 0.1 mM, β-ME 0.1% (v/v), inhibidores de proteasas Complete™). Se recoge el lisado celular y se centrifuga a 14.000 rpm durante 30 min a 4ºC.
• El sobrenadante conteniendo las proteínas celulares totales se transfiere a un tubo nuevo y se almacena a -20ºC hasta su uso.
• La cantidad de proteína de los extractos se cuantifica empleando el método colorimétrico de Biuret y el kit comercial Coomasie Plus reagent (Pierce). La concentración de proteína se determina interpolando la absorbancia a 495 nm de las muestras en una recta patrón construida con cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (BSA).

1. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

• Lavar, secar y montar los cristales que contendrán el gel de poliacrilamida.
• Preparar 10 ml de gel separador al 8% de poliacrilamida: 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 8% acrilamida, 0.2% bis-acrilamida, 2 mM EDTA, 0.1% SDS. Añadir inmediatamente antes de polimerizar el gel 0.1 % TEMED, 0.1% persulfato amónico. Tras depositar el gel dentro de los cristales, cubrir con una  fina capa de agua para obtener un frente recto. Dejar polimerizar durante 30 min.
•  Preparar 5 ml de gel concentrador al 4% de poliacrilamida: 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% acrilamida, 0.11% bis-acrilamida, 2 mM EDTA, 0.1% SDS. Añadir inmediatamente antes de polimerizar el gel 0.1 % TEMED, 0.1% persulfato amónico. Tras depositar el gel dentro de los cristales, colocar el peine de 10 pocillos y cubrir con una fina capa de agua. Dejar polimerizar durante 30 min.
• Retirar el peine con mucho cuidado de no distorsionar la forma de los pocillos. Colocar el gel dentro de la cubeta y añadir dentro de la misma unos 800 ml de tampón de electroforesis TBS: Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0.1% (p/v). El tampón debe cubrir tanto la zona de los pocillos (polo negativo) como la parte inferior del gel (polo positivo).
• Poner en un volumen de 25 μl: extracto proteico celular hasta 25 μg y tampón de carga (Tris-HCl 62.2 mM pH 6.8, SDS 10% (p/v), glicerol 50% (v/v), azul de bromofenol 0.025% (p/v), β-ME 20% (v/v)). Incubar a 100ºC durante 5 min y dejar enfriar a RT.
• Cargar las muestras desnaturalizadas (25 μl) en los pocillos del gel. Desarrollar la electroforesis a 50 V hasta que el frente de las muestras entre en el gel separador (inferior) e incrementar el voltaje a 100 V hasta el final de la migración. Cargar una calle con 10 μl de marcadores de peso molecular pre-teñidos Detener el proceso cuando el frente azul se encuentre próximo al final del gel.

1. Transferencia Western

• Desmontar los cristales con cuidado de no romper el gel.
• En una cubeta conteniendo tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol 20% (v/v)) colocar sobre la parte oscura del módulo perforado (polo positivo) los siguientes elementos en este orden: esponja, 2 piezas de papel, membrana de nitrocelulosa, gel de poliacrilamida, 2 piezas de papel, esponja. Cerrar el módulo, introducirlo en la cubeta de transferencia y llenar con tampón de transferencia.
• Transferir toda la noche a una intensidad de 100 mA a 4°C.

1. Inmunodetección y cuantificación

• Desmontar el módulo de transferencia y separar la membrana del gel. Incubar la membrana de nitrocelulosa en solución Pounceau S (Ponceau S 0.5% (p/v), ácido acético 5% (v/v)) a RT durante 10 min. Eliminar el exceso de colorante lavando con agua destilada y marcar las calles y las bandas correspondientes a la calle de los marcadores de peso molecular.
• Utilizando una hoja de bisturí recortar el fragmento de membrana correspondiente a 30 kDa (PCNA). Recortar también la zona de 45 kDa para aislar la proteína β-actina que será utilizada como control de carga y de integridad del extracto proteico. Lavar con agua hasta eliminar totalmente el Pounceau S.
• Bloquear las membranas en una solución de TBS-T (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 75 mM, Tween-20 0.2% (v/v)) conteniendo leche desnatada o al 5% (p/v) durante 2 h a RT.
• Lavar la solución de bloqueo con TBS (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 75 mM) e incubar cada membrana por separado en esta misma solución toda la noche a 4°C con los siguientes anticuerpos primarios: PCNA a una dilución 1:100 y β-actina a una dilución 1:1000.
• Eliminar el exceso de anticuerpo primario con 3 lavados de 10 min cada uno en TBS-T con agitación.
• Incubar con los anticuerpos secundarios siguientes durante 45 min a RT en TBS: membrana PCNA con anti-mouse a una dilución 1:10.000 y membrana β-actina con anti-rabbit a una dilución 1:20.000.
• Eliminar el exceso de anticuerpo secundario con 3 lavados de 10 min cada uno en TBS-T con agitación.
• Hacer un lavado final en TBS y añadir a cada membrana una cantidad de reactivo de revelado (luminol femto, Pierce) necesario para cubrirlas (aprox. 0.5 ml). Incubar en semioscuridad durante 5 min.
• Eliminar el exceso de reactivo y cubrir las membranas con plástico transparente. Exponer y escanear en el equipo Image Quant (GE). Cuantificar la intensidad de la señal de expresión proteica. Normalizar la expresión de PCNA por la de β-actina y realizar una representación gráfica.

PRACTICA 3: ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR

En esta práctica se llevará a cabo un ensayo de viabilidad celular tras someter a las células a un tratamiento que induce muerte celular. Se emplearán células de neuroblastoma humano SH-SY5Y y como agente inductor de muerte celular el ión Zinc.

1. Cultivo de células y tratamiento

• Cultivar las células SH-SY5Y al 80% de confluencia en placas estériles de 24 pocillos (24-well) en medio completo conteniendo DMEM-F12, 10% de FBS, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml. Mantener a 37°C en atmósfera estéril conteniendo 5% CO2. Tratar 2 pocillos con 200 μM de Zn2+ (punto 48 h). Al día siguiente tratar 2 pocillos más con la misma concentración de zinc (punto 24 h). Dejar 2 pocillos adicionales sin tratar como control de viabilidad.

1. Medida de la viabilidad celular por el método de reducción del MTT a formazán

• Con este esquema de tratamiento, la viabilidad celular se determina simultáneamente en los cultivos control y tratados, ya que todos terminan en el mismo día.
• Aspirar/eliminar el medio de cultivo.
• Reemplazarlo por 1 ml de solución salina básica BSS (TES 5 mM pH 7.4, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 0.33 mM Na2HPO4, D-glucosa 10 mM) conteniendo 150 μg/ml de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio).
• Incubar durante 60 min a 37°C en atmósfera estéril conteniendo 5% CO2.
• Aspirar/eliminar la solución y añadir 1 ml de dimetil-sulfóxido (DMSO) para disolver el precipitado de formazán que se haya formado. Aspirar con la micropipeta arriba y abajo hasta disolución total.
• Medir la absorbancia de la solución a 490 nm y 650 nm en cubetas de plástico de 1 ml.
• Realizar el cálculo A650nm-A490nm y representar viabilidad celular frente a tiempo.

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