Transformación y purificación E. coli

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INTRODUCCIÓN

La primera parte de esta práctica consiste en transformar una colonia de E. coli K-12 en una colonia capaz de sintetizar la proteína GFP,  que le aporta fluorescencia al exponerlas a luz UV y resistencia al antibiótico ampicilina. Para conseguirlo se utiliza el plásmido pGLO. Este plásmido contiene un gen para la resistencia a la ampicilina y un gen para la síntesis de la proteína GFP que se activa en presencia de arabinosa.

La segunda parte consiste en la purificación de la proteína GFP obtenida en la transformación bacteriana anterior mediante columna de interacción hidrofóbica. Para ello se hace una siembra masiva de colonias transformadas, se rompen bacterias mediante lisozima y congelación para liberar la proteína y se utilizan la columna para eliminar el resto de sustancias y obtener así la proteína GFP pura.

• PROCEDIMIENTO

SESION 1

• Para la realización de esta práctica el primer paso es la preparación de las placas. En nuestro caso Agar LB, que preparamos en un matraz erlenmeyer con 10 gr. de LB Broth y 7.5 g de Agar en 500 ml de agua desionizada. Se autoclava durante  25 minutos a 121ºC.

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• Reconstituimos la ampicilina y la arabinosa con 3 ml de solución de transformación.

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• Reconstituimos la cepa de E. coli con 250 µl de solución de transformación.

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• Se rotulan las placas antes de verter el medio. Se planifican 10 placas LB, 18 placas LB/amp y 18 placas LB/amp/ara, es decir, 1 placa LB, 2 LB/amp , 2 LB/amp/ara por grupo y 2 excedentes.

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• Al terminar el ciclo de autoclavado esperamos a que el medio se enfríe hasta unos 45ºC. Se preparan las placas LB. A continuación añadimos el contenido del vial de Ampicilina, agitamos y se preparan las placas LB/amp. Por último añadimos el contenido del vial de Arabinosa, agitamos y preparamos las placas LB/amp/ara.

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• Se dejan enfriar las placas en la campana de flujo antes de llevarlas a la nevera, donde se conservarán hasta su uso.

SESION 2

• Se siembra una placa de agar LB con la cepa E. coli K-12. Para ello utilizamos asa de siembra o hisopo estéril. Se recomienda usar la siembra en cuatro cuadrantes.

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• Se incuban las placas en estufa durante 48 horas a 37ºC
• Se reconstituye el plásmido pGLO liofilizado con 250 µl de Solución de transformación.

SESION 3

• Preparar termobloque a 42ºC
• Preparar baño de hielo
• Identificar 2 tubos eppendorf como + pGLO  y –pGLO.
• Dispensar en cada uno de los eppendorf 250 µl de Solución de transformación.
• Colocarlos en el cooler
• Añadir a cada eppendorf una colonia de E. coli procedente de la placa Agar LB y deshacer haciendo girar el asa dentro del eppendorf. Mantener en el cooler.
• Observar a la luz UV el vial del plásmido
• Introducir un asa de siembra estéril en el vial del plásmido y coger solución. Llevarlo al microtubo +pGLO.
• Llevar los dos eppendorf a baño de hielo durante 10 minutos.
• Identificar placas de cultivo como:

• LB/amp                    +pGLO
• LB/amp/ara            +pGLO
• LB/amp                    - pGLO
• LB/amp/ara             -pGLO

• Llevar los dos eppendorf al termobloque a 42ºC durante 50 segundos.
• Llevar de nuevo a baño de hielo durante 2 minutos.

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• Añadir a cada uno de los eppendorf 250 µl de caldo LB y mezclar. Para ello utilizaremos pipetas pasteur estériles diferentes.
• Agitar a mano y transferir 100 µl de los microtubos a las placas correspondientes.
• Extender utilizando asas de Drigalski en forma de L estériles.

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• Incubar a 37ºC 48 horas.

SESION 4

• Observamos el crecimiento en las placas de transformación (+pGLO) y de control         (-pGLO). Observar también la fluorescencia de las placas a la luz UV. Realizar el recuento de colonias.

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• Preparamos 50 ml de caldo LB.
• Autoclavar 25 minutos a 121ºC.
• Rehidratar los viales de Ampicilina y Arabinosa con 3 ml de tampón TAE.
• Dejar enfriar el caldo y añadir 0.5 ml de ampicilina y 0.5 ml de arabinosa. Se añade también 1 ml de tampón TAE para intentar solventar el error cometido en la reconstitución de los viales.
• En un tubo Falcom de 15 ml identificado se dispensan 2.5 ml de caldo LB y una colonia de E. coli transformada (fluorescente obtenida en la placa LB/amp/ara). Se deshace la colonia agitando el asa estéril en el interior del tubo.
• Se incuban los tubos en posición horizontal y en agitación constante a 37ºC durante 48 horas.

SESION 5

• Reconstituir la lisozima con 1 ml de tampón TE

• Observar el tubo con luz UV.
• Transferir 2 ml del contenido del tubo Falcom a un eppendorf identificado con una pipeta pasteur estéril.
• Centrifugar durante 5 minutos a máxima velocidad

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• Decantar el sobrenadante con cuidado de no alterar el pellet.
• Observar el pellet a luz UV

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• Añadir 250 µl de tampón TE .Deshacer el pellet utilizando la misma pipeta pasteur.
• Añadir 1 gota de lisozima y agitar a mano
• Congelar una media hora para conseguir la ruptura completa de la bacteria.
• Preparar las columnas agitándolas enérgicamente para resuspenderlas.  Luego agitar como un termómetro y colocar en posición vertical para que sedimente.
• Abrir el tapón superior y la pestaña inferior para que caiga el buffer. Si quedan restos por las paredes de la columna se puede añadir un poco de buffer de equilibrio para arrastrar.
• Descongelar el tubo eppendorf y centrifugar 10 minutos a máxima velocidad.
• Observar el tubo a la luz UV

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• Transferir 250 µl del sobrenadante  a otro eppendorf identificado. Añadir 250 µl de Binding Buffer y agitar.
• Cuando la columna esté totalmente vacía verter 250 µl de la mezcla anterior y desechar el eluido.

• Cuando la columna esté totalmente vacía verter 250 µl de Wash Buffer y desechar el eluido. Observar estos eluidos a la luz UV

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• Cuando la columna esté totalmente vacía añadir 750 µl de buffer TE y RECOGER EL ELUIDO. Observar dicho eluído a la luz UV.

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• Guardar este eluido en un eppendorf identificado en el congelador.

• CONCLUSIONES

A pesar de que hubo algunas incidencias siempre hubo algún grupo que consiguiera los resultados esperados y esto nos permitió seguir  con la práctica.

De la siembra realizada en la sesión 2 se debería haber obtenido un crecimiento masivo de colonias sin ninguna transformación y, por lo tanto, sin fluorescencia.

En la sesión 3 se utiliza la solución de transformación y se someten las células a choque térmico para aumentar la permeabilidad de la membrana y permitir la entrada del plásmido. Exponemos el plásmido a luz UV y no observamos fluorescencia, ya que sin la presencia de arabinosa el gen GFP no se activa.

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