Western Blot
Enviado por copitas • 31 de Agosto de 2014 • 2.744 Palabras (11 Páginas) • 367 Visitas
TÉCNICA WESTERN BLOT
INTRODUCCIÓN
Una parte importante en la investigación es la purificación e identificación de diferentes moléculas biológicas, cómo las proteínas. Las cuales deben de encontrarse libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuadamente. La primera etapa es el aislamiento de las proteínas, habitualmente las proteínas son liberadas de las células. El método de elección depende del tejido de procedencia, así como la localización de las proteínas en la célula. Si la proteína se localiza en el citosol, su liberación sólo requiere la apertura de la célula por ruptura (lisis), es el método más sencillo y suave de efectuar. Ya separada la proteína de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificación. Existen diferentes métodos de purificación como por ejemplo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía sobre papel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de resolución elevada (HPLC), la electroforesis, etc.
El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Extracción de proteína Para realizar electroforesis
Tubos ependorf de 2 ml y 600 l 1 Cámara de electroforesis:
Centrífuga a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC 1 Fuente de poder
1 Juego de micropipetas con puntas 1 Baño María 95 oC.
Hielo
Cámara multipozos o gradilla para ependorff 1 Jeringa Hamilton de 50 l
Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 l.
Determinación de proteínas Para realizar el Western Blot
1 Cámara de transferencia: 2 placas de plástico.
2 Cajas de plástico para contener la membrana de transferencia 8.5 X 5.5. cm
4-5 Cajas de plástico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones.
Para realizar 2 geles: 1 Fuente de poder
1 Agitador de placas.
2 Viales con agitador magnético. Regla y lápiz
1 Parrilla con agitación. Hielo
Guantes Papel filtro Watman no. 3
2 juegos de vidrios limpios. 2 peines Membrana de Nitrocelulosa
1 Juego de micropipetas con puntas Tubos para centrífuga de 50 y 10 ml, Costar
SOLUCIONES
Extracción de Proteínas
BUFFER DE LISIS Para 25 ml.
TRIS-HCl 50 mM 0.197 g
NaCl 120 mM 0.1753 g
IGEPAL 0.5 % 0.125 l y aforar
Ajustar pH 8.0 y agregar
NaF 100 mM 0.105 g
NaVO3 200M 0.006 g
Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua)
Preparación del Gel
Solución Acrilamida-Bis
Acrilamida 14.6 g
Bis-acrilamida 0.4 g
Agua desionizada 50 ml Solución 1.5 M tris-HCl pH 8.8
Tris-base 18.5 g
Agua desionizada 100 ml
Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4º C
SDS al 10 %
SDS 10 g
Agua desionizada 100 ml
almacenar a temperatura ambiente Solución 0.5 M tris-HCl pH 6.8
Tris-base 6 g
Agua desionizadas 100 ml
Ajustar a pH 6.8 con HCl almacenar a 4º C
Persulfato de Amonio al 10%
Persulfato de amonio 1g
Agua dest. 10 ml
(preparar sólo lo necesario o guardar por 10 días a 4ºC)
Preparación de las muestras de proteínas
Buffer para muestras 4X
Tris-HCl pH=6.8 (0.5 M) 0.6 ml del de 1.5 M
glicerol 0.8 ml
SDS al 10 % 1.6 ml del de 20%
Azul de bromofenol 0.05 % 0.4 ml
-mercaptoetanol 0.4 ml
Agua desionizada 4.2 ml
Almacenar a T° ambiente. 8 .0 ml
Electroforesis
Buffer de corrida
1X 10 X .
Tris Base 3 g 30 g
Glicina 1.44 g 14.4 g
SDS 1 g 10 g
Agua desionizada 1 L 1 L
Transferencia
Buffer de transferencia
Tris-base 03.03 g
Glicina 14.4 g
Metanol
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