Biogénesis y procesamiento de los microARNs

Biogénesis y procesamiento de los microARNs En una gran proporción los microARNs son generados a partir de un transcripto primario largo, en un proceso secuencial de dos reacciones las cuales son guiadas 292 PABÓN Y. por Drosha y Dicer, en la llamada vía canónica de generación de microARNs. Sin embargo, actualmente han sido descritos microARNs generados por vías alternas llamadas vías no canónicas9 , muchos de los microARNs procesados por estas vías no satisfacen la definición clásica de microARNs. Vía canónica de biogénesis de microARNs En la vía canónica los microARNs son inicialmente transcriptos en el núcleo a partir de precursores largos de ARN llamados microARNs primarios o (pri-microARNs, del inglés primary transcritps). La transcripción de los genes de microARNs generalmente es mediada por la ARN polimerasa II24; sin embargo, un grupo menor de microARNs asociados con repeticiones Alu pueden ser transcriptos por la ARN Polimerasa III25. Los (pri-microARNs) generados por la ARN polimerasa II tienen usualmente varias kilobases de longitud y contienen estructuras en forma de horquilla compuesta de un tallo y un bucle3 . En el primer paso de la maduración de los primicroARNs, Drosha cliva el tallo de la estructura larga de ARN en forma de una horquilla pequeña y permite su liberación3 . Para ello, Drosha necesita un cofactor, DGCR82 ; juntos Drosha y DGCR8 forman el complejo microprocesador2 . Un pri-miARNs típico en metazoos consiste de un tallo de aproximadamente 33 pares de base, un bucle terminal y segmentos flanqueantes de ARN de cadena sencilla (ssARN, del inglés single strand RNA). La proteína DGCR8 interactúa con los pri-microARNs a través de los segmentos de ssARN y el tallo, permitiendo que Drosha realice el clivaje aproximadamente 11 pares de bases, contadas a partir de la unión ARN de cadena sencilla - ARN de cadena doble (ssARN-dsARN, del inglés single strand – double stranded RNA). El complejo microprocesador genera una horquilla de 70 nucleótidos, llamado precursor de microARNs (pre-microARNs, del inglés precursor miRNA). Los pre-microARNs poseen dos nucleótidos colgantes en su extremo 3´ y un grupo fosfato en el extremo 5´, lo cual es característico de los ARN procesadas por la Ribonucleasa III (RNasa, del inglés Ribonuclease III). Finalmente, los pre-microARNs son exportados del núcleo al citoplasma por medio de la exportina 54 . En el citoplasma, los pre-microARNs son reconocidos por el complejo de procesamiento de pre-microARNs formado por Dicer, la proteína de unión a ARN en respuesta a trans-activación (TRBP, del inglés TAR RNA-binding protein) y la proteína quinasa activadora dependiente de ARN de cadena doble inducible por interferón (PRKRA, del inglés protein kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent activator). En el complejo de procesamiento de pre-microARNs Dicer cliva los pre-microARNs cerca del bucle terminal, generando un dúplex de microARN maduro de aproximadamente 22 nucleótidos (microARN:microARN* ), este dúplex contiene una cadena madura de microARN y su cadena complementaria, la cadena pasajera (microARN* )6 . Posteriormente, este complejo se ensambla con la proteína Argonauta 2, para formar el complejo silenciador inducido por microARNs (miRISC, del inglés miRNA-induced silencing complex), el cual selecciona la cadena madura o guía25. La cadena guía es la responsable de dirigir el silenciamiento. Notablemente, la estabilidad termodinámica del extremo 5´ de las cadenas que conforman el dúplex de microARN maduro determina la identidad de la cadena guía y la cadena pasajera26. Sin embargo, dependiendo de la complementariedad perfecta o incompleta de la cadena de microARN a su blanco, el complejo MiRISC puede conducir al clivaje y degradación del ARNm o a la inhibición de la transcripción. En caso de la inhibición de la transcripción, el ARNm reprimido es traslocado a los cuerpos P, donde puede ser destruido o relocalizado en la maquinaria transcripcional bajo la expresión de una señal celular especifica27. La complementariedad perfecta de bases entre la secuencia semilla del microARN (del segundo al octavo nucleótido del extremo 5´) y la secuencia complementaria del extremo 3´UTR es lo que permite que los microARNs modulen la expresión génica7 . El complejo miRISC puede inhibir la expresión de los ARNm blancos por dos mecanismos: (1) remoción de la poliadenilación del extremo 3´ del ARNm, fomentando la actividad de las deadenilasas, seguidas por la degradación del ARNm; y (2) bloqueando el paso de la iniciación o elongación de la traducción, inhibiendo el factor eucariótico de la elongación o causando un estancamiento del ribosoma28 (Figura 1). Vías no canónicas de generación de MicroARNs Gracias al avance en las tecnologías de secuenciación ha sido posible generar gran cantidad de información que ha sido analizada, ordenada y procesada obteniéndose datos valiosos sobre subclases de microARNs en diversos tipos de células de diferentes organismos, muchos de los cuales sólo cumplen parcialmente la definición clásica de microARNs. La mayoría de estos análisis, clasifican los microARNs teniendo en cuenta únicamente, dos criterios: la expresión de un ARN de 293 MicroARNs: una visión molecular aproximadamente 22 nucleótidos y la presencia de un precursor en forma de horquilla23. Actualmente, se ha descrito que la mayoría de los mamíferos, y la especie H. sapiens, utilizan la vía canónica para la generación de microARNs. Sin embargo, para organismos como Drosophila megaloblaster, Giardia lamblia, Zebrafish y Murine Gamma-herpesvirus 68 se ha descrito la producción de microARNs por vías no canónicas. Por lo cual, es de esperar que las células usen una variedad de transcriptos como fuentes de microARNs y utilicen diferentes mecanismos de generación. Las vías no canónicas son una prueba de la flexibilidad y habilidad de las células para generar estructuras en forma de horquilla como pre-microARNs29-33 (Tabla 2). Diferencias y similitudes entre la vía canónica y las vías no canónicas de generación de microARNs Las vías canónicas y no canónicas de generación de microARNs incluyen en su maquinaria dos enzimas: Drosha y Dicer, que realizan su efecto a nivel del núcleo y citoplasma, respectivamente. Sin embargo, la principal diferencia entre la vía canónica y las vías no canónicas, es que tan solo los microARNs de ambas proteínas, Drosha y Dicer; a diferencia de las vías no canónicas, que pueden utilizar tan solo una de estas dos proteínas. De acuerdo a la utilización de la enzima Drosha o Dicer, los microARNs generados por vías no canónicas pueden ser agrupados en dos grandes categorías: (i) microARNs producidos por vías no canónicas independientes de Drosha y (ii) microARNs producidos por vías no canónicas independientes de Dicer (Tabla 2).

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