Aniridia Enfermedad Congenita

Abstracto

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Aniridia es una condición panocular congénita y progresiva con mal pronóstico visual que se asocia con el cerebro, olfativa, y anormalidades pancreáticas. Desarrollo de la aniridia está vinculada con mutaciones sin sentido que resultan en la caja emparejada 6 (PAX6) haploinsuficiencia. En este caso, se utilizó un modelo de ratón de la aniridia para probar la hipótesis de que la manipulación de la dosis Pax6 través de una estrategia de supresión de mutación sin sentido-mutación independiente limitaría el daño progresivo, post-natal en el ojo. Nos centramos en los medicamentos de supresión sin sentido 3 - [5 - (2-fluorofenil)-3-il 1,2,4-oxadiazol] benzoico (ataluren) y gentamicina. Sorprendentemente, hemos demostrado que la supresión de las mutaciones no sólo inhibe la progresión de la enfermedad, sino también de la córnea de forma estable invertido, lentes, y defectos de malformación de la retina y restaurados respuestas eléctricas y de comportamiento de la retina. Los resultados más exitosos se han logrado a través de la aplicación tópica de la formulación del fármaco START (cloruro de odium 0,9% s, 1% T ween 80, 1% de polvo de un taluren, 1% ca rboxyme t hylcellulose), que fue diseñado para mejorar la dispersión de partículas y para aumentar la viscosidad de la suspensión. Estas observaciones sugieren que el ojo conserva la plasticidad del desarrollo marcado en el periodo postnatal y sigue siendo sensible a la remodelación molecular. Además, estos datos indican que otras anomalías del desarrollo neurológicos asociados con mutaciones genéticas dosis-sensibles pueden ser reversible a través de la terapéutica de supresión de las mutaciones.

Introducción

El factor de transcripción altamente conservada paired box 6 (PAX6) es fundamental para el desarrollo embrionario y el mantenimiento en el ojo, cerebro, sistema olfativo, y el páncreas ( 1 ). Los defectos genéticos que conducen a la haploinsuficiencia dePAX6 causan aniridia congénita ( 2 ), una condición panocular progresiva caracterizada por la ausencia de tejido del iris, opacidad corneal, glaucoma, cataratas, e hipoplasia de la fóvea, que también se asocia con el cerebro, olfativa, y anormalidades pancreáticas ( 3 ). Mientras que la base genética de la aniridia congénita se conoce desde hace 2 décadas, esto aún no se ha traducido en estrategias de tratamiento PAX6 preventivas o correctivas, principalmente debido a la heterogeneidad alélica PAX6, ya se conocen más de 600 mutaciones diferentes ( 4 ).Codones de terminación prematuros (PTCs) causadas por mutaciones sin sentido, mutaciones sitio de empalme y mutaciones de cambio representan el 72% de todas las enfermedades asociadas a mutaciones PAX6 ( 4 ), sin embargo, aproximadamente el 50% de todas las mutaciones son mutaciones sin sentido en el marco. Por lo tanto, razonó que un enfoque supresión mutación sin sentido-mutación independiente de los PTC en marco ( 4 ) podría ser relevante para muchos pacientes si esto podría lograrse a través de una estrategia post-natal. En este enfoque, durante la traducción de ARNm, un ARNt aminoacil-cerca de cognado se inserta en el polipéptido. Por lo tanto, siempre que el PTC no está en una posición crítica para la actividad de la proteína, a continuación, una proteína funcional se produciría con el potencial de proporcionar un beneficio terapéutico ( 5 ).

Nosotros y otros han llevado a cabo con anterioridad experimentos de prueba de concepto que demuestran que los aminoglucósidos promover la lectura a través de los PTCs ( 6 - 9 ), sin embargo, carecen de la potencia y la frecuencia están asociados con efectos sistémicos adversos ( 10 ). Recientemente, sin sentido de la supresión de pequeñas moléculas con efectos tóxicos limitados se han descrito ( 11 ). Por lo tanto, en este estudio se prueba una pequeña estrategia molécula tonterías postnatal supresión de los defectos de malformación que presenta el modelo de ratón deficiente de Pax6 aniridia (Pax6 Sey + / -).

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Resultados y Discusión

Supresión de las mutaciones sistémica postnatal.

Como habíamos probado anteriormente aminoglucósidos en rata y pez cebra modelos mutaciones sin sentido ( 8 , 9 ), se optó por la gentamicina para las pruebas preliminares en vivo. También seleccionamos 3 - [5 - (2-fluorofenil) -1,2,4-oxadiazol-3-il] benzoico (Ataluren) para la supresión de mutaciones, porque se sabe que es el medicamento menos tóxico en los seres humanos ( 12 ) . Para los estudios in vivo, hemos utilizado el ojo pequeño semidominante (Sey Pax6 + / -) modelo de aniridia, que tiene un origen natural Gly194X detener la mutación del codón (UGA) en el gen Pax6ratón ( 13 ). Nuestro paradigma terapéutico inicial fue inyecciones subcutáneas diarias de 30 ataluren mg / g o 6,25 g / g de gentamicina de P4 a P14 en Pax6 Sey + / -ratones. En ojos mutantes, antes del tratamiento en P4, la córnea se espesó, hubo un tallo lenticular en la que la lente subdesarrollado se adjunta a la córnea, y la retina se espesó y anormalmente infolded en el margen ciliar (Figura (Figure1A).1 A). Sin tratamiento, en P14 el Pax6 Sey + / - globo se distorsiona aún más, invaginación progresiva se observó en la retina mutante, y la lente era anormalmente pequeño. Sin embargo, el tratamiento resultó en Ataluren corrección de invaginación de la retina y también dio lugar a un aumento de tamaño de la lente al 70% de la observada en los de tipo salvaje ojos. Del mismo modo, el tratamiento con gentamicina, a partir ya sea prenatalmente en E12.5 o post-parto a P4 y continuando hasta P21, dio lugar a notable normalización de los defectos de malformación ocular (Figura Suplementario 2; material complementario disponible en línea con el presente artículo; doi:10.1172/JCI70462DS1 ) . Esto demostró que el desarrollo del tejido controlado porPax6 expresión sigue siendo sensible a la manipulación después del nacimiento. Sin embargo, las observaciones en el segmento anterior del ojo mostraron que el estroma de la córnea en animales tratados se espesó anormalmente (Figura (Figure2A).2 A). El análisis detallado mostró que en P14 el espesor del epitelio corneal en los ojos no tratados fue de 9 ± 2 m (n = 6), en los ojos tratados fue de 10 ± 3 m (n = 6), y en el de tipo salvaje ojos medido 38 ± 2 m (Figura (Figure2B).2 B). El tratamiento continuado con Ataluren a P60 no mejoró significativamente este anormal del epitelio corneal adelgazamiento (14 ± 3 m,n = 6). Esto sugirió que la droga limitada de la administración sistémica se había llegado a la córnea. Cabe señalar, sin embargo, que el desarrollo del segmento anterior del ojo es en parte dependiente de no-celular de señalización autónoma PAX6 de la lente y de la migración de células de la cresta neural ( 14 ) y puede haber contribuido a los defectos corneales. Una evaluación más detallada de la retina mostró que hubo también una densidad significativamente mayor de embalaje de núcleos de fotorreceptores en ataluren tratados Pax6 Sey + / - retinas (376 ± 17 núcleos por 200 m de anchura de la retina, P <0,001, n = 5) en comparación con la en los de tipo salvajePax6 + / + retinas (263 ± 12 núcleos por 200 micras de anchura de la retina, n = 5) y que los fotorreceptores tenido segmentos internos y externos más cortos (Figura (Figure2E).2 E).Esto es consistente con una retina menos maduros en comparación con animales de tipo salvaje de la misma edad. La retina no tratado no tenía segmentos exteriores, y todas las otras capas de la retina eran más delgados que los de tipo salvaje o de los ojos tratados. La densidad de empaquetado de los núcleos de fotorreceptores en la retina sin tratar fue 172 ± 11 núcleos por 200 m de ancho (n = 5).

Figura 1

Tratamiento postnatal de los ratones Pax6 con ataluren.

Figura 2

Retina y la histología de la córnea en Pax6 Sey + / - ratones.

Supresión de las mutaciones sistémica rescata parcialmente los déficits funcionales de la retina.

Estamos próximos determinar si ataluren tuvieron un efecto perceptible sobre los déficits funcionales de la retina utilizando el electrorretinograma (ERG) ( 9 ). Las retinas de Pax6 no tratados Sey + / - ratones a P60 tuvieron una respuesta ERG indetectable (Figura (Figure3A,3 A, trazar 2) Sin embargo, las respuestas sustanciales ERG se registraron en los ratones tratados hasta P60 (Figura. (Figure3A,3 A , traza 3). Tanto escotópica y fotópica amplitudes b-onda (Tabla (Tabla 1)1 ) fueron significativamente menores (P ≤ 0,01,P ≤ 0,05, respectivamente, n = 6) que los de los ratones de tipo salvaje (Figura ( Figure3B),3 B), lo que sugiere rescate incompleta. Es importante destacar que, en los experimentos de abstinencia en el que la supresión de mutaciones fue detenido en P21 y los ratones fueron probados en P60, no se observó ninguna reducción en el ERG (tabla (Tabla 1),1 ), lo que sugiere que los beneficios del tratamiento se mantuvieron estables.

Figura 3

Electrorretinográfica analiza en respuesta a la estimulación de la luz.

Tabla 1

Datos del ERG para diferentes regímenes de tratamiento

Supresión de las mutaciones tópico Postnatal invierte patología.

Desde nuestras observaciones sugirieron que el ojo posnatal era todavía sensible aPax6 dosis pero que beneficio terapéutico sistémico se limita en la córnea, la hipótesis de que una mejor respuesta podría lograrse usando la aplicación tópica en el ojo. Esto aumentaría la concentración del fármaco en el ojo al tiempo que limita aún más cualquier toxicidad sistémica ( 12 ). Una suspensión acuosa Ataluren 1% fue entregado por vía tópica al ojo (50-100 g por ojo) dos veces al día

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