BIOQUIMICAS

PRACTICO N° 4

PROPIEDADES BIOQUIMICAS Y ENZIMATICAS

DE LAS BACTERIAS

La fisiología bacteriana comprende procesos tan complejos como la obtención de energía (fotosíntesis o quimiosíntesis), la nutrición, los ciclos de transformación de elementos de primordial importancia en el equilibrio vital, tales como nitrógeno, azufre y carbono, la cromogénesis.

Las bacterias se caracterizan por una amplia versatilidad metabólica, son capaces de degradar una infinidad de compuestos orgánicos para obtener carbono, nitrógeno y energía. La diferencia en cuanto a las fuentes de carbono y nitrógeno utilizada se debe a la diferencia bioquímica de cada bacteria. Es decir, difieren en la ruta biosintética, productos metabólicos y batería enzimática.

En microbiología, la diferenciación bioquímica y enzimática requiere del siguiente estudio de las vías metabólicas:

• Reconocimiento de metabolitos intermedios que se acumulan durante la fermentación de los azúcares.

• Demostración de actividades enzimáticas características.

• Utilización de fuentes de carbono.

• Demostración de reacciones individuales.

La información obtenida de estos estudios permite reconocer y clasificar las bacterias (fisiotaxonomía bacteriana) y de esta forma diagnosticarlas. Desde el punto de vista práctico, la fisiología bacteriana estudia el comportamiento bioquímico y enzimático de las bacterias de acuerdo a las reacciones que se producen en los medios diferenciales.

Las propiedades bioquímicas son Sacaroliticas, Proteoliticas, Lipoliticas, Oxido reductoras.

En este práctico estudiaremos principalmente las 2 primeras.

1. PROPIEDADES SACAROLITICAS

Las bacterias tienen enzimas que hidrolizan los hidratos de carbono en forma parcial o total, por el proceso denominado fermentación. Los carbohidratos existen en la naturaleza en forma de polisacáridos, cadenas de azúcares de 6 carbonos (hexosas), cadenas de 5 carbonos (pentosas), etc y monosacáridos.

Los polisacáridos son demasiados grandes y complejas para ser asimilados por las bacterias. El desdoblamiento de los polisacáridos mediante las enzimas, se realiza en varias etapas, lo que reduce el tamaño de las moléculas en cada etapa hasta que estos sean lo suficientemente sencillos como para difundir al interior de la bacteria.

El desdoblamiento de los monosacáridos es un proceso complejo, la molécula de glucosa, por ejemplo, después de una serie de transformaciones en que participan numerosas enzimas (hexoquinasas, isomerasas, transfosforilasa) se transforma en Acido Pirúvico.

La forma en que las bacterias desdoblan el Acido Pirúvico es variable y depende de la especie bacteriana que actúe, dando origen a los distintos tipos de fermentaciones bacterianas y a distintos compuestos finales como: Acido Láctico, Acetilmetilcarbinol, Acido Butírico, etc.

FERMENTACION DE AZUCARES.

La fermentación se estudia en medios de cultivo líquidos o sólidos, que contienen un azúcar determinado (Lactosa, Glucosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol) y un indicador ácido base conocido. La interpretación se basa en el viraje del indicador hacia el color ácido (por la producción de ácidos orgánicos como Acido Láctico, Pirúvico, Succínico, como producto final de la fermentación) cuando la bacteria ha actuado con sus enzimas sobre el azúcar que contiene el medio. También se produce gas, que en los medios sólidos se visualiza por la ruptura del agar y en los medios líquidos por la acumulación de gas en la campana Durham.

a) Agar Mac Conckey y Agar SS.

Este agar es en placa tiene Lactosa y como indicador Rojo Neutro. La fermentación del azúcar hace virar el indicador desde el rojo al color fucsia.

Colonias de color Fucsia : Lactosa (+)

Colonias transparentes : Lactosa (-)

AgarS-S(+) AgarMacConkey(-) AgarMacConkey(+)

Medio de Cultivo Propiedades Enzimáticas que se observan en el medio Lectura de la Reacción Cambio de Color del Medio Cambio de pH Interpretación de la reacción

Agar Mac Conkey Sacarolítica Lactosa (+) Colonias de color rojo con un halo turbio Ácido La bacteria degrada la lactosa presente en el medio de cultivo

Lactosa (-) Colonias incoloras, medio de cultivo amarilo No hay cambio La bacteria no degrada la lactosa presente en el medio de cultivo

Agar SS (Salmonella Shigella) Sacarolítica y Proteolítica Lactosa (+) Colonias rosadas a rojo, medio rojo Ácido La bacteria degrada la lactosa presente en el medio de cultivo

Lactosa (+) y H2S (+) Colonias rosadas a rojo, centro de la colonia negro Ácido La bacteria degrada la lactosa presente en el medio de cultivo y hay producción de H2S

Lactosa (-) y H2S (+) Colonias incoloras, transparentes, centro negro No hay cambio La bacteria no degrada la lactosa y hay producción de H2S

b) Agar XLD (Xilosa, lactosa, desoxicolato)

Este medio es en placa, contiene 3 azucares que son xilosa, lactosa, glucosa y como indicador de pH Rojo fenol. La fermentación de las azúcares hacen virar el indicador desde el rojo al color amarillo.

• Colonias amarillas, medio amarillo: Xilosa, lactosa y sacarosa (+):

En este medio también podemos ver descarboxilación de aminoácidos que corresponde a propiedades proteoliticas en donde se descarbixila la lisina presente en el medio y este vira a un rojo purpura-

XLD (+) a la utilización de azucares XLD (+) Descarboxilacion de la lisina

Medio de Cultivo Propiedades Enzimáticas que se observan en el medio Lectura de la Reacción Cambio de Color del Medio Cambio de pH Interpretación de la reacción

Agar XLD (Xilosa, Lactosa Desoxicolato ) Sacarolítica y Proteolítica Xilosa, lactosa y sacarosa (+) Colonias amarillas, medio amarillo Ácido La bacteria degrada la xilosa, lactosa y sacarosa del medio

Xilosa, lactosa y sacarosa (+) y H2S (+) Colonias amarillas, medio amarillo con pp negro Ácido La bacteria degrada la xilosa, lactosa y sacarosa del medio y hay producción de H2S

Decarboxilación de lisina (+) Colonias del mismo color del medio o rojo púrpura con pp negro Alcalino La decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura

Decarboxilación de lisina (+) y H2S (+) Colonias del mismo color del medio o rojo púrpura con pp negro Alcalino La bacteria decarboxila la lisina y hay producción de Acido sulfhídrico

c) Agar TSI

El agar TSI (Triple Sugar Iron) es un agar semi tendido que se siembra en superficie y en profundidad. Contiene 3 azúcares: Lactosa, Sacarosa y Glucosa y como indicador de pH Rojo Fenol.

Después de 24 horas de incubación a 37°C, si la superficie (tendido) permanece rojo y la profundidad vira a amarillo (K/A), se ha producido la fermentación de la glucosa (etapa anaeróbica de la glucolisis ).

Si tanto la superficie como la profundidad viran al amarillo (A/A), se han fermentado los 3 azúcares.

La presencia de gas se reconoce por la ruptura del agar y nos dice que la fermentación del azúcar fue completa ya que si no hay ruptura del medio la fermentación es incompleta.

Tubo K/A : Glucosa (+), Lactosa y Sacarosa (-). Rojo en superficie y amarillo en profundidad

Tubo A/A : Glucosa, Lactosa, Sacarosa (+). Amarillo en superficie y en profundidad.

Tubo K/K : No hay fermentación. El tubo se mantiene rojo en superficie y profundidad

Nota: K= Alcalino (Rojo), A= Acido. (Amarillo)

2: K/A

3: K/ A con producción de H2S

4: A/A con gas

5: A/A con H2S

Medio de Cultivo Propiedades Enzimáticas que se observan en el medio Lectura de la Reacción Cambio de Color del Medio Cambio de pH Interpretación de la reacción

Agar TSI (Triple Sugar Iron) Sacarolítica y Proteolítica A/A sin gasH2S (-) Amarillo en superficie y profundidad sin pp negro Ácido La bacteria fermentó en forma parcial la lactosa, sacarosa y glucosa presente en el medio de cultivo

A/A con gas y H2S (+) Amarillo en superficie y profundidad con pp negro y ruptura de agar Ácido La bacteria fermentó en forma completa la lactosa, sacarosa y glucosa y hay producción de H2S

K/A con gas y H2S (+) Rojo en superficie y amarillo en profundidad con pp negro y ruptura de agar Ácido La bacteria fermentó solo la glucosa en forma completa y hay producción de H2S

K/A sin gas H2S (-) Rojo en superficie y amarillo en profundidad sin pp negro Ácido La bacteria fermentó solo la glucosa en forma parcial y hay producción de H2S

K/K Rojo en superficie y profundidad No hay cambio No hay fermentación de azúcares ni producción de H2S

PRODUCCION DE ACETOINA

Algunas bacterias como E. Coli, Salmonella, Shigella, etc. Fermentan la Glucosa con formación de grandes cantidades de ácidos orgánicos. Otras bacterias fermentan la Glucosa con producción de productos neutros como 2-3 butanediol que es rápidamente oxidado a acetilmetilcarbinol (acetoína) y di-acetilmetilcarbinol, sustancias que no bajan considerablemente el pH del medio de cultivo.

Para la detección de estos productos neutros se utiliza la Prueba de Voges Proskauer (VP): se incuba un Caldo Glucosado a 37 ° C por 24-48 horas, posteriormente

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