Determinación De Nitrosaminas En Alimentos

Introducción

Los N-nitrosocompuestos son agentes teratógenos, mutágenos y probables carcinógenos, altamente peligrosos para la salud humana. Se originan como consecuencia de la reacción de las aminas secundarias (aromáticas y alifáticas) con el ácido nitroso (Almudena Antón y Jesús Lizaso;2001)

Si bien se forman gran variedad de estos compuestos, los más significativos desde el punto de vista de la toxicología alimentaria son las dialquilnitrosaminas, las nitrosaminas de estructura cíclica y acilalquil-nitrosaminas o nitrosamidas.

En la mayoría de los alimentos se encuentran en bajas concentraciones, generalmente inferiores a 10 mg/kg y rara vez exceden los 100 mg/kg. Sin embargo, las verduras, principal aporte de estos compuestos en la dieta junto con los embutidos, presentan unos contenidos que oscilan entre 200 y 2.500 mg/kg, variando en función del procesado del alimento, uso de fertilizantes y condiciones de crecimiento.

La presencia natural de nitratos en las plantas es una consecuencia del ciclo del nitrógeno, en el que la planta asimila el nitrógeno inorgánico en forma de nitratos para utilizarlos en la síntesis de proteínas vegetales. Por ello los nitratos se encuentran de modo natural en las verduras en forma de nitrógeno inorgánico en los fluidos celulares y en la savia como precursor de la formación de proteínas.

Los nitratos se encuentran también en el agua potable, debido fundamentalmente a la presencia natural de los mismos, o a la contaminación de los suministros de agua por prácticas agrícolas (fertilizantes y estiércol) y/o por vertido de las aguas residuales urbanas. Los nitratos se emplean también como aditivos en el curado de carnes, debido a sus propiedades bacteriostáticas al fijar un pH ácido (pka HNO3 1,73 y pka HNO2 3,37) que previene el botulismo y a su capacidad para fijar el color rojo. Por lo tanto, las tres fuentes principales de ingestión de nitratos en la dieta europea son las verduras, el agua y la carne curada. Las verduras constituyen la fuente más importante de nitratos en la dieta aportando más del 80% de la ingesta diaria.

La formación endógena de N-nitrosocompuestos comienza cuando los nitratos son reducidos a nitritos por los microorganismos de la cavidad bucal y estos nitritos se transforman después en óxido nítrico en el estómago debido a las condiciones allí existentes. Bajo circunstancias específicas, como la gastritis crónica, los nitritos pueden oxidarse en el estómago a agentes nitrosantes (N2O3, N2O4) y reaccionar para formar N-nitrosocompuestos, el pH óptimo para que ocurra esta reaccion es 3,4.

Esta reacción se produce con precursores nitrosables, que incluyen una gran variedad de componentes de la dieta tales como: aminas secundarias (pescados, huevos, quesos, carnes...), precursores naturales en los alimentos (como ciertos aminoácidos), los alcaloides presentes en especias que se emplean para curar carnes (pimienta negra), y otros precursores que aparecen en los alimentos como contaminantes (plaguicidas, aditivos o medicamentos). También incluye el consumo de sal como factor irritante de la mucosa gástrica y la acidez del estómago

Algunos estudios parecen demostrar que la nitrosación endógena produce cantidades de N-nitrosocompuestos suficientemente grandes como para representar un riesgo relevante en condiciones habituales de ingesta de nitratos. Por otra parte, otros estudios, tales como los de epidemiología en poblaciones que tienen una dieta rica en verduras, han revelado la existencia de una correlación negativa entre la ingesta de nitratos y el cáncer gástrico. Esto se debe, casi con toda certeza, a la protección frente a la nitrosación gástrica que ofrecen los inhibidores naturales de la dieta, tales como la vitamina C, que es un componente importante de las frutas y verduras.

Formación de nitrosaminas: La mayoría de los compuestos N-nitroso de interés en toxicología alimentaria son probables o posibles carcinógenos en humanos. En animales de experimentación son potentes carcinógenos, en todas las especies ensayadas, y tiene amplia organotropicidad, según donde se biotransforma para dar radicales libres alquilantes (alquildiazonio y alquilcarbonio). En los estudios epidemiológicos se ha sugerido su intervención en el desarrollo del cáncer nasofaríngeo, esofágico y gástrico. Las nitrosaminas generadas ejercen sus efectos carcinógenos mediante este poder alquilante: la unión de los grupos alquilo (incluso los grupos metilo, de pequeño tamaño) es suficiente para interferir en el apareamiento de las bases en la doble hélice de ADN. Este daño conlleva mutaciones y, con éstas, una probabilidad mayor de carcinogénesis. Por todo ello, las exposiciones a compuestos N-nitroso y sus precursores deben mantenerse en el nivel más reducido posible, siguiendo las recomendaciones de la OMS.

Para la determinación de Nitrosaminas se creó una gelatina que simulaba un alimento sólido real, a la cual se le agregó concentraciones de NA iguales a las comúnmente encontradas en muestras reales a partir de una solución estándar de 2000ug/ml de un mix de las 9 nitrosaminas a determinar. La obtención de estas se llevó a cabo mediante un proceso de microextracción en fase sólida acoplada a un dispositivo de extracción directa (SPME-DED) a diferentes temperaturas (4 y 25°C) y tiempos de 15 minutos y 20 horas de extracción con concentraciones de NA en un rango de 1-50 ng/ml. Luego la separación y detección de estas se realizó con cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) con modo ion selectivo (SIM).

Pretratamiento de la muestra

La técnica de extracción utilizada es la microextracción en fase sólida acoplada a un dispositivo de extracción directa (SPME-DED), la cual se basa en la extracción de los analitos de la matriz de la muestra mediante una fibra de sílice fundida que está recubierta de un sorbente, en la mayoría de los casos polimérico, seguida de la desorción de los analitos mediante temperatura. DED es un cilindro hueco y perforado que permite la introducción de la fase de SPME en el interior del mismo, de forma que el conjunto SPME-DED se puede introducir directamente en la matriz sólida, facilitando así la extracción de compuestos volátiles de alimentos sólidos sin el deterioro del producto. De esta forma, se facilita su manipulación y al mismo tiempo se protege la fibra cuando no se utiliza, ya que ésta permanece dentro del dispositivo. Esta técnica presenta una serie de ventajas frente a otras técnicas de preconcentración ya que es muy simple, presenta un bajo costo, puede ser automatizada, requiere pequeños volúmenes de muestra y no precisa del uso de disolventes orgánicos para llevar a cabo la preconcentración. SPME es un proceso que combina muestreo, extracción y concentración en un solo paso. Otra ventaja que presenta es la posibilidad de utilizarse con todos los tipos de muestras, ya sean gaseosas como por ejemplo aire o aliento, líquidas como aguas o bebidas, o sólidas como sedimentos, alimentos, etc. Además, se puede aplicar a la determinación de compuestos de diferente volatilidad como es el caso de las Nitrosaminas que serán detectadas en alimentos.

En el proceso de SPME se pueden diferenciar principalmente dos etapas. Una primera etapa de extracción en la que la fibra recubierta del sorbente se pone en contacto con la muestra de alimento, durante un tiempo y temperatura determinadas, de manera que se produce una migración de los analitos desde la solución a la fibra hasta que se alcanza la situación de equilibrio, el tiempo de equilibrio es aquél a partir del cual la cantidad de analito extraída se mantiene constante. Después de esta primera etapa, se realiza la desorción de los analitos retenidos por la fibra.

Existen básicamente dos modos de extracción posibles en SPME, introduciendo la fibra directamente en la muestra, para el caso de muestras sólidas o bien en el espacio de cabeza o headspace para muestras en estado gaseoso. Para aumentar la velocidad de la extracción es necesario utilizar un sistema de agitación de manera que se facilite la difusión de los analitos hacia la superficie de la fibra.

En lo que respecta a la etapa de desorción, ésta se realiza térmicamente en el inyector de un cromatógrafo de gases, de forma que al aumentar la temperatura, la afinidad de los compuestos por la fibra disminuye y los analitos son introducidos en la columna analítica por el flujo del gas portador. Los puertos de inyección, generalmente los inyectores split/splitless de los cromatógrafos de gases son muy adecuados para llevar a cabo la desorción de los analitos de la fibra. En la determinación de nitrosaminas se utiliza el modo splitless.

Actualmente hay fibras con diferentes recubrimientos de manera que la SPME puede usarse para determinar un amplio grupo de compuestos, además se pueden mezclar diferentes recubrimientos de manera que se consiguen fibras muy selectivas para un determinado compuesto. La fibra de polidimetilsiloxano (PDMS), que es un polímero líquido es la más adecuada para los analitos apolares, aunque en algunos casos, también puede ser usada para la determinación de analitos con cierta polaridad. En general, se recomienda utilizar las fibras de mayor espesor, como la de 100 μm, para compuestos con coeficientes de partición bajos y de poco espesor para los que presenten coeficientes de partición elevados.

En el caso de la extracción de Nitrosaminas se utiliza una fibra de carboxen/polidimetilsiloxano (CAR/PDMS) de 85 um de espesor, en donde la extracción de los analitos de la muestra se debe a un fenómeno de adsorción. Cuando el CAR se mezcla con

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