Informe # 3. “Conteo bacteriano y tiempo de generación”

Informe # 3.  “Conteo bacteriano y tiempo de generación”

1. Objetivo general

 Estudiar el crecimiento bacteriano en cultivo de BHI para para el microorganismo E. coli para generar la curva de crecimiento y calcular el tiempo de generación de la cepa utilizada.

1. Objetivos específicos

• Calcular el tiempo de generación de E. coli a partir de la curva de crecimiento bacteriano
• Diferenciar los resultados obtenidos por absorbancia y por conteo en placa en términos de exactitud y selectividad.
• Construir una curva de crecimiento donde el pH pueda evidenciarse

1. Introducción

En el crecimiento de poblaciones, se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana.. Durante este ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican y la velocidad de crecimiento (número de células o masa celular por unidad de tiempo) está limitado por las características del medio en el que se encuentra dado que en un sistema cerrado donde el alimento se agota y los desechos de metabolismo se acumulan el crecimiento se detiene (fase estacionaria) y luego disminuye (fase de muerte)[]^[a]. El tiempo requerido para que una célula se reproduzca se denomina tiempo de generación, o también conocido como tiempo de duplicación. Durante la fisión binaria, tanto el número de células como la masa celular se duplica y el tiempo que toma  para duplicarse varía ampliamente entre los microorganismos, desde minutos, horas hasta días. [ ^[b]

Este modelo de incremento de la población en el que el número se dobla cada cierto periodo de tiempo se le conoce como crecimiento exponencial, cuando esto se representa en ejes de escala aritmética (Gráfica 3. (b)), se obtiene una curva característica la cual se va incrementando progresivamente la pendiente. Como es tan difícil obtener información de la velocidad, también se podría realizar una gráfica en donde se presenta el número de células en escala logarítmica (Gráfica 3. (a)), frente al tiempo, lo cual da una línea recta. La función de línea recta es un indicador de que las células están creciendo exponencialmente.  ]^[c]

El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo los cambios en el número de células o el peso de biomasa celular, que pueden estimarse de manera directa o indirecta. Existen diversos métodos para contar el número de células (ej. citómetro de flujo, técnica de filtración en membrana, métodos de recuento de viables[]^[d]) o la masa celular (ej. peso seco microbiano, espectrometría[]^[e]).

Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido , el resultado al cabo de un tiempo es una colonia. Consecuente a esto se denomina Unidad Formadora de Colonia (UFC), es la unidad de medida que se emplea en la cuantificación de microorganismos, para contar o estimar el número de bacterias o células viables en una muestra sólida o líquida. La viabilidad se define como la habilidad de reproducirse como indicio de que la célula está viva, para realizar conteo de viables mediante el método de siembra en placa los dos más utilizados son: la siembra por extensión y la siembra en profundidad[]^[f]. El método utilizado fue el de siembra en superficie, en donde se extiende por toda la superficie un volumen no mayor a 0,1 mL de dilución, la placa se incuba de 48 a 72 horas para evidenciar el crecimiento. Cada dilución se hizo con la finalidad de reducir la carga microbiana y poder contar adecuadamente, pero la concentración tampoco puede ser muy bajo para que el conteo sea estadísticamente representativo. [pic 1]

Como se desconoce el número de viables es necesario hacer más de una dilución, generalmente son seriadas en base 10, es decir 1ml de muestra va a 10 ml de medio de cultivo líquido. Y esta secuencia de dilución se realiza en diez tubos de ensayo, la muestra es tomada inicialmente del cultivo a estudiar y posteriormente del tubo inmediatamente anterior después de realizar una buena dispersión. Por ejemplo, si 1mL de una dilución 1X10-6 da lugar a 150 colonias, significa que la muestra original contenía aproximadamente 1,5X10-8 células por mililitro[]^[g].

Se realizó la curva de crecimiento poblacional de la E. coli, es un bacilo gramnegativo que pertenece a la familia de las enterobacterias, es decir, que se encuentra generalmente en el intestino de los organismos de sangre caliente, ya que se desarrolla a temperaturas alrededor de 37ºC. Es un microorganismo anaerobio facultativo, es decir que puede desarrollarse tanto en condiciones anaerobias como aerobias, posee movilidad gracias a flagelos que rodean su cuerpo, no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa, y la lactosa. [  ]^[h]

El medio de cultivo que se utilizó tanto en forma de caldo como agar sólido fue el BHI Agar, agar de infusión de cerebro y corazón, en este agar se obtienen nutrientes como la peptona, y la glucosa. las peptonas y la infusión son fuentes de nitrógeno orgánico, carbono, azufre, vitaminas y micronutrientes. la glucosa es la fuente de carbohidratos que los microorganismos utilizan mediante la fermentación. Se utiliza fosfato disódico como tampón en el medio, es decir sin presencia de microorganismos tendrá un pH de +/- 7. [  ^[i]]

La forma de caldo se utilizó para realizar las diluciones y el crecimiento primario de las bacterias de donde se tomaron los inóculos para la siembra y el agar se utilizó para la siembra como tal, en donde crecieron las unidades formadoras de colonias.

1. Resultados y análisis de resultados

El dia de la siembra se tomó la absorbancia de las muestras de donde se tomaron los inóculos para la siembra y para realizar las diluciones, con el fin de obtener una estimación del número de células mediante la utilización de medidas de turbidez. La turbidez se puede medir con un espectrofotómetro, son instrumentos que hacen pasar la luz a través de la suspensión y detectan la cantidad de luz no dispersada.

[pic 2]^{[j][k][l][m][n][o]}

Gráfica 1. Absorbancia a 540 nm Vs. Tiempo del caldo de cultivo

En la gráfica 1. se observa un comportamiento exponencial ya que se mide, a través de la turbidez, el crecimiento bacteriano en el transcurso del tiempo. Una suspensión bacteriana es turbia porque las células dispersan la luz que atraviesa dicha suspensión (imagen 1), entre mayor concentración de células,  más se dispersa la luz y por lo tanto más turbia es la suspensión, es decir que con los resultados de la gráfica podemos afirmar que hubo crecimiento bacteriano. [pic 3]

Este método de medición tiene la virtud de ser rápida y fácil de tomar, además que se pueden tomar sin distorsionar la muestra, por esta razón se utiliza ampliamente para seguir y tener control de los cultivos  microbianos. [  ]^[p] Pero tiene como desventaja que no puede dar cuenta de interferencias por el medio o de posible muerte celular, dado que estos también dispersan la luz, por eso debe ir acompañada de una forma que nos de cuenta de la viabilidad.

[pic 4]

Gráfica 2. pH Vs. tiempo del caldo de cultivo

Así como se midió la absorbancia de de cada tiempo, se midió el pH mediante el instrumento pH-metro. En el tiempo 0 se evidencio un pH de 7 debido a las condiciones iniciales del medio, explicadas anteriormente. Mediante pasa el tiempo, se observa una leve disminución en el pH, que podría basarse en que hubo crecimiento microbiano de E. coli, capaz de fermentar la glucosa presente en la infusión, produciendo ácido el cual hace disminuir el pH del medio. La gráfica 2. presenta un pico pronunciado de pH entre el tiempo 1 y 2, se considera que esta disminución inconstante sea debido a la poca muestra tomada para medir el pH, por lo tanto el electrodo, la parte del instrumento que se sumerge en la solución para medir el pH, no estaba cubierto completamente por la suspensión y tocaba a veces con las paredes del recipiente generando una lectura de pH muy variable dificultando la concepción de la validez de los datos.^[q][r] Por otro lado, comparando con un reporte en literatura []^[s] se realiza un cultivo de S. cerevisiae con E. coli y se realiza la curva de crecimiento midiendo pH y también presenta picos pronunciados de pH en T3 y T6 (que son los de interés debido a que en la práctica solo se tomaron 6 mediciones). Se puede considerar que la variabilidad en el pH es propia de E.coli o de la combinación de estas dos cepas, lo cual indicaría que sin importar la cantidad de muestra el instrumento utilizado es bastante sensible y reporta resultados acertados.

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