Informe Bioquimica

PRACTICA No. 2

NOMBRE: FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD

1. OBJETIVOS:

 Obtener las fracciones de albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biológicos.

 Calcular mediante espectrofotometría, la concentración de proteínas en cada una de las fracciones anteriores.

 Comprobar la teoría con la práctica en relación al comportamiento según la solubilidad de proteínas.

2. MARCO TEORICO:

1. Solubilidad y precipitación de las proteínas: La solubilidad de una proteína está influenciada por los siguientes factores:

a.) Su composición en aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es en general más soluble que una rica en aminoácidos hidrofóbicos)

b.) Su estructura tridimensional (las proteínas fibrosas son en general menos solubles que las globulares).

c.) El entorno de la propia proteína, en este último sentido, podemos decir que los principales factores ambientales que influyen en la solubilidad de una proteína son los siguientes: la temperatura; la constante dieléctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza iónica.

La precipitación de proteínas es un método comúnmente usado para separar las proteínas en fluidos biológicos complejos (suero, plasma, sangre y orina), y así poder estudiar y ver cómo se comportan pequeñas moléculas.

Normalmente los fármacos y otras pequeñas moléculas son monitorizados rutinariamente y estos estudios requieren el aislamiento de los compuestos en estudio del resto de la matriz proteica de la muestra antes de su análisis.

Las proteínas son precipitadas de sus soluciones por ciertos ácidos tales como Zn +++, Hg ++, Fe ++, Cu++ y Pb ++. En general se aplica esta precipitación para los precipitantes pacidos a través de la formación catiónica de las moléculas de proteína.

2. Clasificación de Osborne de las proteínas, por el criterio de solubilidad

En 1907, Osborne separó las proteínas del trigo en cuatro fracciones en función de sus solubilidades, extrayendo sucesivamente de una muestra de harina las albúminas, con agua, las globulinas, con una disolución salina y las prolaminas, con etanol acuoso al 70%. Las glutelinas quedan en el residuo de la harina.

3. Métodos cuantitativos para la determinación de proteínas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford.

Biuret: El sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos dando un complejo de coloración violeta. La intensidad del color obtenido es una medida del número de enlaces peptídicos presentes en la proteínas.

Folin-Lowry: Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin para dar un complejo colorado. El color que se forma es debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína, tal como sucede en el ensayo de Biuret y la reducción de fosfomolibdato por la tirosina y el triptófano presentes en la proteína. La intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes y cambiaran según la clase de proteína.

Bradford: se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de Ac. Fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm.

Ejemplo de la curva de calibración:

3. METODOLOGIA:

Preparación de la muestra

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de: arveja, soya, fríjol, haba, trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y centrifugar la suspensión a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior.

Después de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extracción se adiciona al balón que contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase. Así se tiene separada la fracción de las albúminas.

Sobre el residuo que queda de la separación de las albúminas, se repite ahora todo el proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Después de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extracción con NaCl al 1%, se llevan a otro balón aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fracción de las globulinas.

Sobre el residuo anterior se extrae en idéntica forma la fracción de las prolaminas, usando esta vez alcohol etílico al 75% y una temperatura de extracción cercana a 60°C.

Por último sobre el mismo residuo, con la adición de solución de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiento general, se separa la fracción de las glutelinas.

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