Práctica De Azúcares Totales

Facultad de Ingeniería Química

Ingeniería en Biotecnología

“Práctica #4: Determinación de azúcares totales”

Bioquímica I

Integrantes:

Concha Syndel

Herrera Claudia

Ortega Juan Carlos

Vallejo Mario

30/04/15

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 1

OBJETIVO 3

METODOLOGÍA 3

Preparación de reactivos 3

Procedimiento 3

RESULTADOS 5

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6

CONCLUSIÓN 8

ANEXO 1: Cuestionario 8

REFERENCIAS 11

INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes de la Tierra, conformados principalmente por cadenas de carbohidratos e hidrógenos por medio de una cadena simple. Entre las funciones destacan que son fuentes de energía, reserva, estructurales o comunicación celular

Los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. El contenido total de carbohidratos de medios líquidos, extractos o alimentos puede ser determinado como azúcares simples (monosacáridos), oligosacáridos (polímeros con dos hasta unos 20 residuos de monosacáridos), polisacáridos (son polímeros que contienen más de 20 residuos de monosacárido) y sus derivados (glucoproteína). Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. Este método propuesto por Dubois y cols. (1956) es un método fácil, eficaz y rápido. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar (Nielsen, 1998). La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos por espectrofotometría se basa en la utilización del método colorimétrico de fenol-sulfúrico que depende de la deshidratación de sacáridos derivados de hidrolizados a furfural, que transcurre en el proceso de la reacción. Cuando estos compuestos reaccionan con fenol y en presencia de ácido sulfúrico concentrado se observa un color amarillo-naranja muy estable. Los derivados del furfural con las formas del fenol colorado adsorbe a longitud de onda de 490 nm.

Reacción:

FENOL + H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO  HMF (amarillo naranja)

Para hexosas (hidroximetilfurfural)

Para pentosas (metil furfusal)

OBJETIVO

Ensayar la cuantificación de carbohidratos totales por el método Fenol-ácido sulfúrico.

METODOLOGÍA

Preparación de reactivos

Fenol 5%. Pesar 5 g de fenol y agregar 95 mL de agua bidestilada.

Solución estándar de glucosa. Pesar 10 mg (0.01 g) de glucosa y disolverla en agua bidestilada aforando a 100 mL. Se tiene una solución de 100µg de glucosa/mL.

Solución de sacarosa 1%. Pesar 1 g de azúcar común y agregar 99 mL de agua destilada, disolver completamente.

Solución de almidón 1%. Pesar 1 g de almidón y agregar 99 mL de agua destilada. Agitar esta solución antes de usarse.

Procedimiento

Desproteinización de las muestras

1. Tomar 0.5 mL del cultivo con sacarosa y colocarlo en un microtubo.

2. Agregar 250 µL de Sulfato de zinc al 10%.

3. Adicionar 250 µL de NaOH 0.5N

4. Dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente

5. Centrifugar a 10,000 rpm durante 5 min.

6. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrifuga y reservar hasta la determinación de azúcares totales.

Determinación de azúcares totales

1. Tomar 1 ml de la solución de azúcar que contenga entre 10 y 70 µg. Algunas veces es necesario hacer diluciones de la muestra. Para esta práctica realizar las siguientes diluciones: Sacarosa (10:1000 veces), Almidón (10:1000 veces); Medio de cultivo con sacarosa (10:1000veces).

2. Añadir 0.5 ml de fenol 5 %.

3. Agregar 2.5 ml de ácido sulfúrico concentrado.

4. Mantener en reposo durante exactamente 10 min.

5. Agitar y poner los tubos en agua fría (25-30 °C) durante 15 min. También puede utilizarse un baño de agua con hielo y disminuir el tiempo. El color es estable por algunas horas y las lecturas pueden ser realizadas más tarde si es necesario.

6. Realizar las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a 490 nm. El color característico para hexosas es amarillo-naranja.

7. Preparar una curva estándar de glucosa como indica el cuadro siguiente.

Conc. De glucosa

µg/mL Sol. Estándard de glucosa (100 µg/mL) mL Agua (mL)

0 0 1.0

10 0.1 0.9

20 0.2 0.8

40 0.4 0.6

60 0.6 0.4

80 0.8 0.2

100 1.0 0.0

8. Aplicar a la curva estándar el mismo procedimiento descrito en los puntos 7 al 12 de este procedimiento.

RESULTADOS

Curva de calibración

Concentración

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