Bq Lipidos

3. El enlace peptídico

Los aminoácidos se encuentran unidos en los péptidos y las proteínas mediante un enlace amida (-CO-NH-):

Este enlace se forma por reacción entre el grupo -COOH de un aminoácido y el -amino del siguiente (con pérdida de una molécula de agua) y recibe el nombre de enlace peptídico.

Entre los años 1930-1940, Pauling y Corey, mediante el estudio de Rayos X de cristales de aminoácidos, dipéptidos y tripétidos, dilucidaron la estructura tridimensional del enlace peptídico (Figura 4). Así, descubrieron que la unión C-N del enlace peptídico era más corta que en la mayor parte de los demás enlaces C-N y llegaron a la conclusión de que el enlace debía tener algún carácter de doble enlace, por la aparición de dos formas resonantes:

Luego dedujeron que los 4 átomos que rodeaban al enlace peptídico C-N (O, C, C, H) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el oxígeno del grupo carbonilo y el hidrógeno del N-H estarían en posición trans. Esta ordenación es rígida, y es el resultado de la estabilización por resonancia de las formas anteriormente citadas.

Partiendo de estos dos hechos, puede describirse el armazón de una cadena polipeptídica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los C. De esta forma podemos escribir la estructura de un péptido como una sucesión de planos en la que los grupos -R se van alternando (Figura 5).

4. Secuenciación de un péptido

La secuencia de un péptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales. La insulina bovina fue la primera proteína que se secuenció completamente por Sanger en 1953, lo que le valió el premio Nobel. La determinación de la secuencia de la insulina fue el resultado del trabajo de muchos científicos durante 10 años, desde entonces se han secuenciado miles de proteínas.

La secuencia de un péptido, si conocemos el gen del que proviene, puede secuenciarse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero también puede hacerse la secuenciación química directa. Los pasos a seguir son:

- Determinación de la composición del péptido por hidrólisis total y posterior análisis cromatgráfico.

- Determinación de los extremos C-terminal y N-terminal

- Fragmentación por hidrólisis selectiva

- Secuenciación: Degradación de Edman

• La determinación de la composición del péptido se realiza por hidrólisis total presencia de HCl 6N, calentando a 100 °C durante 10-24h, y en tubo al que se le ha hecho el vacío. Tras el proceso se utiliza un sistema cromatográfico que permita separar y determinar cuántos y cuáles son los aminoácidos que forman la cadena.

• La determinación de los extremos C-terminal y N-terminal. Hay métodos que permiten determinar el primer aminoácido (Resto N- terminal) o el último (Resto C- terminal) de una cadena polipeptídica.

La determinación del resto N-terminal, se puede realizar, entre otros métodos, mediante la Degradación de Edman: en este proceso el péptido reacciona con fenil isotiocianato que se une selectivamente al primer aminoácido. A continuación se escinde con HF anhidro el aminoácido marcado, separándolo del resto selectivamente con un disolvente orgánico. Tras un tratamiento en medio ácido el compuesto resultante se determina cromatográficamente (Figura 6).

Por otro lado, la determinación del resto C-terminal, se puede realizar con Hidracina: este compuesto reacciona con todos los enlaces peptídicos del péptido, provocando la hidrólisis de los mismos y dando lugar a aminoacil-hidracinas con todos los aminoácidos excepto con el último (C-terminal), pudiendo separarse del resto fácilmente y determinarse con posterioridad su naturaleza.

Fragmentación por hidrólisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden secuenciarse péptidos con mas de 20 o 30 aminoácidos. Se realiza con reactivos selectivos (en la mayoría de los casos proteasas) que hidrolizan determinados enlaces peptídicos.

La tripsina hidroliza por la derecha de Arg , Lys

La quimotripsina hidroliza por la derecha de Phe, Trp, Tyr

La pepsina hidroliza por la izquierda de Phe, Trp, Tyr

La termolisina hidroliza por la izquierda de Val, Leu, Ile

El bromuro

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