Aplicación de un extracto enzimático de lisozima obtenido de Gallus gallus para el tratamiento de bacterias resistentes a antibióticos en aguas residuales en la ciudad de Ibarra

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Aplicación de un extracto enzimático de lisozima obtenido de Gallus gallus para el tratamiento de bacterias resistentes a antibióticos en aguas residuales en la ciudad de Ibarra.

Arciniega Génesis^[1], Arroyo Mariana1, Cruz Melanie1, Enríquez Jhostin1, Rosero Melanie1

Facultad de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias y Ambientales (FICAYA), Universidad Técnica del Norte, Imbabura, Ecuador

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INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO        RESUMEN

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1. Materiales y métodos

1. Evaluación de la carga microbiana de E. coli resistente a CTX

Para determinar la cantidad de carga microbiana presente de E. coli resistente a CTX se obtuvo previamente una muestra del efluente de la PTAR de la Universidad técnica del Norte que se almacena en una laguna, se selló y se refrigeró hasta su uso.

Se realizaron diluciones en serie y siembra por extensión para estimar la carga microbiana, la aplicación de dicha técnica consistió en realizar diluciones seriadas 1:10 y extender 100µl de cada dilución en una placa; dichas placas proceden a incubarse hasta que las colonias sean apreciables para su recuento (Corral, et al,2012). Los medios de cultivo preparados con antelación para este ensayo fueron agar Cromocult y BD Bioxon Caldo Brillante, además del antibiótico Cefotaxima a una concentración de 0,003 mgml-1.

Para el procedimiento se tomó como guía el libro Biología de los microorganismos (Madigan et al., 2015) y el criterio de los docentes del laboratorio de Microbiología de la institución. Inicialmente se realizaron diluciones seriadas hasta un factor de 10-5, ideal para estudios de aguas residuales utilizando 1 ml de la muestra de la PTAR previamente ambientada con 9 ml de medio líquido BD en 3 tubos de ensayo rotulados, el procedimiento se repitió 4 veces más y se escogió al azar un tubo de cada una de las concentraciones para utilizarlo en el conteo.

Seguidamente, se procedió a extender 1 ml de cada tubo escogido en las placas con agar Cromocult que contenían 20 µl del antibiótico preparado, se sellaron las placas y se mandó a incubación por 24 horas a una temperatura de 36 °C para la evaluación de resultados (Fig.1 (A)). Finalmente, se procedió a contar las colonias en base a la ficha de colores del Agar Cromocult y fueron válidas las placas con colonias en un rango entre 30-300 (Madigan et al., 2015).

1. Prueba de susceptibilidad a otros antibióticos

Con la finalidad de obtener datos que sirvan como punto de partida para otras investigaciones similares se realizó una prueba de susceptibilidad de antibiogramas (Prueba de Kirby-Bauer) realizando una comparación entre una muestra de E. coli resistente (Cepa A) aisladas en cultivo puro procedente de

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Fig. 1. Técnicas de evaluación de resistencia de E. coli. A: Diluciones y siembra por extensión. B: Prueba de Kirby-Bauer.

las placas Petri utilizadas en el conteo de colonias y otra muestra sensible (Cepa B) disponible en el laboratorio (Fig.1).

Se sembraron de 3 a 5 colonias de cada una de las placas en un tubo de ensayo junto con 5 ml de Tryptic Soy Broth (TSB) preparado previamente y se procedió a ajustar el inóculo a una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de McFarland (Madigan et al., 2015; Cavalieri et al., 2005). Se inoculó con un isopo 2 placas Petri que contenían 25 ml de agar Mueller Hinton solidificado con cada tipo de E. coli, cubriendo toda la superficie en 3 direcciones diferentes para formar una cama de siembra consistente (Cavalieri et al., 2005).

Después de 5 minutos, se colocaron manualmente 8 discos de antimicrobianos para cada cepa a una distancia mínima de 2,5 cm, los discos utilizados corresponden a los siguientes antibióticos: Gentamicina (CN) 10 mcg, Nitrofurantoina (F) 300 mcg, Amikacina (AK) 30 mcg, Trimetroprima sulfamethoxazol (SXT) 25 mcg, Cefoxitina (FOX) 30 mcg, Ciprofloxacina (CIP) 5 mcg, Tetraciclina (TE) 30 mcg y Ceftazidima /ácido clavulánico (CAZ/CLA) 30/10 mcg. Seguidamente se selló correctamente y se incubó por 24 horas a 36 °C para la observación de resultados (Cavalieri et al., 2005).

1. Extracto enzimático

Las cáscaras de C. papaya son una de las principales partes productoras de desechos de esta especie, por tanto, su reutilización representa un beneficio para el cuidado del medio ambiente y el impulso de la bioeconomía, por ende, se seleccionó esta parte de la especie como muestra vegetal.

1. Preparación del material vegetal

Se utilizó como guía el proceso estipulado por Chaiwut et al. (2007), el material fue obtenido de un fruto maduro de la variedad Siluet procedente de la región Costa de Ecuador, adquirido en la cuidad de Ibarra en un comercio local de frutas. El proceso consistió en remover la cáscara del fruto, estas fueron lavadas con bicarbonato y agua destilada con el fin de eliminar microorganismos de la superficie para luego cortarlas en trozos pequeños. Cabe resaltar que varios trabajos como el de Jain & Student (2020), aplican un secado a una temperatura alrededor de los 55 °C hasta obtener un 90 % p/p de humedad, dicho paso puede ser opcional dependiendo las condiciones del experimento, en este caso no fue realizado por falta de disponibilidad del equipo necesario.

1. Preparación del extracto

El proceso de extracción de proteínas se realizó según las metodologías aplicadas en los trabajos de Chaiwut et al., 2007, 2010; Jain & Student, 2020; Rojas et al., 2018 y Thomás et al., 2009. Se prepararon 10 gramos de la muestra de cáscaras para añadir tampón fosfato 50 mM en una relación 1:6 (p/v), se dejó reposar por aproximadamente 30 minutos en un recipiente esterilizado y se midió el pH. Posteriormente se realizó una trituración con el uso de un mortero con pilón con el objetivo de romper las células fibrosas y componentes celulares para la liberación de las enzimas en el medio.

Se filtró para separar los residuos celulares y se trasladó la muestra líquida a 5 tubos de micro centrifugación previamente esterilizados, luego se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos para separar los residuos celulares restantes de las enzimas colocando el sobrenadante en nuevos tubos y se eliminó los contaminantes con filtros de jeringuilla de 0,2 micras. Finalmente, se almacenó el extracto “crudo’’ a una temperatura de 4 °C para su conservación (Chaiwut et al., 2007, 2010; Jain & Student, 2020; Rojas et al., 2018; Thomás et al., 2009).

1. Cuantificación de proteínas

Para cuantificar la cantidad de proteínas se utilizó como guía los trabajos de Chaiwut et al., (2007) y Thomas et al., (2009) donde se aplica el método de Bradford, el cual se basa en una reacción colorimétrica de proteínas con tinte

Coomassie Azul Brillante G-250 que induce un cambio espectral observado de color marrón a azul en presencia de proteínas.

Se utilizó el reactivo de Bradford y albumina de suero bovino (BSA) a una concentración de 5 mgml-1 disponibles en las instalaciones junto con el tampón fosfato 50 Mm que fue usado para la extracción, se formó una solución de BSA de 1 mgml-1 con un volumen de 1 ml total aforado con el tampón, se realizaron disoluciones seriadas que contuvieran la mitad de la concentración anterior (factor 2x) obteniendo un total de 6 soluciones que servirían como estándares para las mediciones (Chaiwut, et al., 2007; Rojas et al., 2018). Para la aplicación del reactivo de Bradford se agregó 1 ml de este con 0,1 ml de cada uno de los estándares, luego se repitió el proceso tomando 0,1 ml de la muestra del extracto de proteínas obtenido anteriormente para su análisis y se dejó reposar por 15 minutos para su reacción (Thomas, et al.,2009).

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