Biuret

INTRODUCCIÓN

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los

seres vivos, son las más abundantes en el organismo. Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia de este tipo de moléculas (1).

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en propiedades intrínsecas  de las proteínas para absorber la luz UV, la capacidad que tienen las proteínas para unir ciertos colorantes y formación de derivados químicos.

Los métodos más utilizados son el ensayo de Biuret, que es colorimétrico, donde los Cu2+ del reactivo Biuret se unen a los NH de los enlaces peptídicos, otro método utiliza la curva de calibración que es donde se utilizan concentraciones conocidas y son comparadas para determinar muestras problemas, existen muchos métodos para la cuantificación de proteínas, que son  rápidos y efectivos, sin embargo los nombrados anteriormente son los más utilizados (2).

Objetivos:

• Determinar concentraciones de SAB en las distintas disoluciones empleadas en este práctico. Calcular las concentraciones de proteínas en las muestras problemas.
• Utilizar y reconocer método de Biuret en la cuantificación de proteínas.
• Aprender a realizar una curva de calibración y analizar sus resultados.
• Aplicar valores teóricos y compararlos con los experimentales.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se rotularon 8 tubos con los números del 1 al 6 en forma secuencial y 2 con MP1 – MP2. Utilizando una micropipeta p1000, se le agregó a cada tubo las concentraciones que se muestran en la tabla 1 de NaCl 0,9% p/v, SAB 5 mg/mL, clara de huevo diluida 1:20 v/v con NaCl 0,9% p/v (MP1) y orina diluida 1:10 v/v con NaCl 0,9% p/v (MP2). (ver anexo 1)

Después se procedió a calentar los tubos a baño maría y calentarlas durante 5 minutos a 37°C. Al sacarlas del baño se les dejo enfriar sobre el mesón para luego verter las soluciones en cubetas de cuarzo para medir su absorbancia, utilizando la solución de NaCl como blanco.

RESULTADOS

Tabla de resultados de absorbancia y concentración de proteínas

(Ver cálculos de concentración de proteínas en anexo 2)

DISCUSIÓN

El reactivo de Biuret se utilizó porque contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación  de un compuesto  de color violeta,  debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. Para que la reacción sea positiva las proteínas deben contener más de

2 enlaces peptídicos (3).

Según el ensayo de Biuret debe presentar colores violetas o púrpuras para tener una reacción positiva,  es  decir  del  color  azul  natural  del  Biuret  debe  tener  una  decoloración  que  le proporcionara la cantidad de proteínas que contengan las soluciones a comprobar, si observamos las soluciones utilizadas en este experimento, el color violeta o púrpura era notorio en los tubos 4 al 6 lo que significa que tienen una mayor concentración  de proteínas por la coloración que muestra Biuret al mezclarse con estas soluciones, el color es celeste tal vez lila en los tubos 3,2, lo que indica que la concentración de las proteínas no es tanta como para que la unión de Cu2+ con los NH de los enlaces cambie la coloración de la solución. En el tubo 1 y 2 se mantienen azules, pues el NaCl no presenta proteínas y en el tubo 2 es casi despreciable la cantidad de SAB en la solución en comparación al tubo 6. Los tubos que tenían las muestras problemas  en cambio, la que contenía la orina diluida presentó una leve coloración morada (purpura) similar a la que presentó el tubo 4 (el cual contenía SAB diluida en NaCl). Esto es porque la concentración de proteínas calculadas en la orina era cercano a las concentraciones que presentaba el tubo 4 con SAB. El tubo con la clara de huevo diluida, fue la dilución que presento una coloración mucho mas fuerte a diferencia de lo que el resto de los tubos, luego de calcular la concentración de proteínas, arrojó que fue la muestra que poseía una mayor concentración de proteínas.

La concentración (o excreción) de proteínas en la orina en personas normales está en los rangos de 0,15 g/24 hrs. de una muestra. Cuando se excede esta concentración, se produce una proteinuria. Enfermedad que se produce principalmente por un daño en el glomérulo del riñón  lo  que  permite  que  proteínas  de  gran  tamaño  pasen  por  estas  lesiones,  lo  que normalmente,  estas son filtradas en el proceso de la formación de orina (ultrafiltración  de la sangre por la presión hidrostática) (4).

...