El diagnóstico de enfermedades autoinmunes depende de la identificación de síntomas clínicos asociados a la enfermedad y se asocia con la detección de autoanticuerpos

INTRODUCCION

El diagnóstico de enfermedades autoinmunes depende de la identificación de síntomas clínicos asociados a la enfermedad y se asocia con la detección de autoanticuerpos.

Las enfermedades específicas de órganos están asociadas con autoanticuerpos específicos del principal órgano. Los autoanticuerpos pueden representar un estado de actividad de la enfermedad o predecir una condición patógena futura.

El primer método de inmunoensayo enzimático se introdujo en 1972, y desde ese momento se han desarrollado varias formas diferentes de inmunoensayos enzimáticos, que eran análisis simples de alto rendimiento y podían ser automatizados y estandarizados

Los ensayos tradicionales basados ​​en reacciones de hemaglutinación, inmunodifusión y hasta cierto punto, inmunofluorescencia están siendo reemplazados cada vez más por pruebas menos exigentes basadas en técnicas de inmunotransferencia o inmunoensayo enzimático (EIA), ampliamente utilizado para detectar la presencia o concentración de autoanticuerpos individuales en fluidos biológicos. El inmunoensayo múltiple desarrollado recientemente permite la determinación simultánea de diferentes autoanticuerpos, en los que se inmoviliza un gran número de antígenos en un vehículo sólido en matrices espaciales (planas) o matrices espectrales (basadas en perlas)

La estandarización de los métodos de inmunoensayos para la detección de autoanticuerpos es difícil debido al hecho de que no están disponibles los métodos de referencia estándar, los estándares y los materiales de referencia estándar. La especificidad de un inmunoensayo depende principalmente de la especificidad del epítopo del antígeno que se usa para la determinación del autoanticuerpo.

1. MÉTODOS DE DETECCION

1. Microscopia de inmunoflourecencia indirecta

Anticuerpos Anti-Nucleares (ANA)

Los ANA son un grupo diverso de anticuerpos que reaccionan contra antígenos nucleares, nucleolares y perinucleares. Estos antígenos representan a los componentes celulares, tales como los ácidos nucleicos, las histonas, la cromatina y las proteínas nucleares y ribonucleares. Estos ANA son los que clásicamente se emplean para el diagnóstico del LES, pero se pueden encontrar en otras EA. Los métodos usados para detectarlos son la IF con diluciones del suero del paciente frente a un substrato adecuado, 25 pero también se emplean los sistemas de EIE. 9 En la tabla 2 se muestra la sensibilidad y especificidad de varias pruebas de ANA en distintas EA.

Son fundamentales en el diagnóstico y exclusión de enfermedades del tejido conectivo, ya que en éstas son positivos en un porcentaje alto. Pero, a la vez son inespecíficos ya que se pueden encontrar en enfermedades autoinmunes órgano-específicas, en enfermedades no autoinmunes como infecciones crónicas, enfermedades linfoproliferativas y también en población sana (especialmente en personas mayores, en mujeres y en familiares de primer grado de pacientes con enfermedades reumatológicas ANA positivas). Es por esto que su evaluación debe ser hecha dentro del contexto clínico del paciente y con una sospecha diagnóstica que justifique su petición.

Tiene relevancia el título en que son positivos, a mayor dilución más

significativo es su hallazgo.

En personas sanas se describen valores de hasta:

- >1 / 40: 20 a 30%

- >1 / 80: 10 a 12%

- >1 / 160: 5%

- >1 / 320: 3%

Se determinan generalmente mediante IFI en células HEp-2 (células epiteliales humanas de estirpe neoplásica), como sustrato estandarizado. Se pueden también determinar por ELISA

Se describen distintos patrones de fluorescencia, los cuáles se asocian a anticuerpos específicos contra ciertos antígenos y a determinadas enfermedades. Los principales son:

 1. Homogéneo: se asocia principalmente a anticuerpos anti-DNA.

2. Moteado: se asocia a la presencia de anticuerpos anti-ENA (Ro, La, Sm, RNP, Scl-70).

3. Centrómero (ACA): Dentro de los ANA un subtipo importante y que se puede solicitar de manera independiente son los anticuerpos anticentrómero. Reconocen hasta 5 proteínas centroméricas. Su principal característica es su presencia en Esclerodermia limitada, con una sensibilidad de aproximadamente 60% y especificidad de > 95%. Éstos rara vez coexisten con anticuerpos anti Scl-70 (Esclerodermia difusa).

 4. Nucleolar: se asocia a Esclerodermia difusa.

La inmunofluorescencia indirecta

La técnica de IF indirecta (IFI), que emplea cortes de varios tejidos o la línea celular tumoral (HEp-2) de epitelioma laríngeo humano como fuente antigénica, se utiliza ampliamente para el diagnóstico de EA de muchos laboratorios. 25, 26 En la IFI, los antígenos no definidos son reconocidos por los AA en el suero del paciente y ofrecen determinados patrones que tienen que ser interpretados en relación con su asociación a enfermedades, 27 por lo que el patrón de tinción de una muestra positiva se puede usar para evaluar qué especificidades antigénicas son las más apropiadas para detectarlos

Además, aunque la IFI es un método sensible, tiene sus limitaciones, como las variaciones en el substrato, su realización manual, la interpretación subjetiva del resultado, poca reproducibilidad y la falta de estandarización; así como el elevado consumo de tiempo para obtener un resultado, lo que implica poca salida de resultados a corto plazo de tiempo y elevación de los costos del laboratorio en gastos de personal.

Los ensayos inmunoenzimáticos

La mayoría de los laboratorios de Inmunología dedicados al estudio de la autoinmunidad usan los EIE como la técnica básica para detectar los AA.5 El procedimiento principal y central es la captura de los AA del suero de los enfermos por los antígenos inmovilizados. Para ello fueron purificados antígenos importantes de timo de conejo o de bazo humano, o se obtuvieron por técnicas recombinantes.

Los ELISA basados, tanto en antígenos preparados de extractos nucleares de células de líneas tumorales humanas como la HEp-2, o de antígenos nucleares altamente purificados o recombinantes, son las más promisorias, pero se han informado diferencias importantes en términos de positividad al comparar los distintos métodos de EIE disponibles. 32,33

El aislamiento de autoantígenos de fuentes naturales como el tejido humano, provoca grandes limitaciones en reproducibilidad y pureza. Muchas proteínas están presentes solo en muy pequeñas cantidades y su purificación entraña la eliminación de otras dianas antigénicas potenciales. 26 La especificidad de los ELISA para la detección de AA es fuertemente dependiente de la calidad de los antígenos usados y su similitud en secuencia, conformación y en las modificaciones post-transducción con los antígenos humanos.

Los EIE son ampliamente usados para la identificación de AA específicos para antígenos nucleares o citoplasmáticos de diferentes enfermedades órgano-específicas, como la enfermedad de Grave, la cirrosis biliar primaria, la dermatomiositis (DM), o de las sistémicas como esclerosis múltiple (EM), el síndrome de Sjödrem (SjS), la enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC) o la artritis reumatoide (AR).

La ELISA para detectar anticuerpos antinucleares basada en las células HEp-2 (HEp-2 ANA EIA) es un método automatizado con alta reproducibilidad y calibración interna. No obstante, la evaluación de muestras clínicas bien definidas de pacientes con esclerodermia por este método, ofrece menos resultados positivos que la prueba de IFI para ANA

Los inmunoensayos Multiplex

Los inmunoensayos Multiplex permiten la identificación de múltiples AA frente a un determinante antigénico simple de forma simultánea.

Ensayos basados en la tecnología de microarray (microarreglos): los inmunoensayos en tiras de transferencia (line-blot) son inmunoensayos Multiplex que permiten el análisis paralelo de diferentes tipos de AA. Estos usan antígenos recombinantes casi exclusivamente, inmovilizados en líneas rectas sobre una tira de nylon para pruebas, que cuando se incuban con el suero, los AA presentes se enlazan a los autoantígenos en la tira y se visualizan a través de un sistema de detección de color, basado en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. 2

Los resultados se interpretan mediante la comparación de las intensidades del color de la línea de reacción con la del valor de corte, y algunos trabajos publicados sugieren que un pequeño porcentaje de los resultados negativos en la IFI para ANA puede dar positivo en los ensayos en tiras, especialmente para los anti-SS-A/Ro.

La tecnología de microarray planar se desarrolló y aplicó para la detección simultánea de diferentes AA usando el formato de un inmunoensayo tipo sandwich. Los diferentes autoantígenos se inmovilizan en un microarray junto con las proteínas de control. El ensayo se incuba después con el suero del paciente y los AA reaccionantes se detectan gracias a un segundo anticuerpo marcado. La mayoría de los microarrays aplican la quimioluminiscencia o los métodos de fluorescencia para su revelado.

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