Practica Mohos Y Levaduras

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

“Recuento de mohos y levaduras por siembra en placa en todo el medio”

OBJETIVO GENERAL

Al termino de ésta práctica y mediante la aplicación de técnicas de aislamiento de hongos y levaduras, el alumno será capaz de verificar la presencia de los mismos en muestras de alimentos.

INTRODUCCIÓN.

Los mohos y las levaduras son agentes alterantes de un número importante de alimentos. Los hongos se encuentran presentes principalmente en el queso (de cualquier especie o variedad), en el yogurt, en fruta descompuesta (la descomposición es, en algunos casos, precisamente por los hongos ), tortillas húmedas, enlatados, etc. Se presentan también en las harinas con la misma frecuencia que en los granos, pueden afectar mucho y en gran número a la harina y en condiciones de humedad favorable. Debido a ello, es muy importante su control.

Todos los, mohos y levaduras crecen bien a valores de pH 5.0 y aún inferiores, por lo que generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos. Además muchos mohos y algunas levaduras toleran bajas concentraciones de actividad de agua (aw), aproximadamente inferiores a 0.95 mucho mejor que la mayoría de las bacterias. Incluso a valores por debajo de 0.75 algunos mohos y levaduras son los únicos organismos que pueden crecer.

Para el recuento de mohos y levaduras en alimentos generalmente se utilizan por lo general, medios acidificados. Sin embargo, los medios de pH bajo no son enteramente satisfactorios para el recuento de mohos y levaduras ya que muchas bacterias crecen a pH bajo, incluso por debajo de 4.0. De igual manera, algunos mohos y levaduras crecen con dificultad a los valores de pH de algunos de los medios acidificados, especialmente cuando las células han sido dañadas poco antes de las siembras.

Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios para el recuento de mohos y levaduras se han utilizado con eficacia los antibióticos. Entre ellos puede citarse la penicilina en combinación con estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina y la gentamicina. La gentamicina suprime el crecimiento de las bacterias Gram –Negativas y es efectiva por ello en alimentos tales como la carne refrigerada. La mejor temperatura de los cultivos se sitúa alrededor de 22°C y el tiempo de incubación más adecuado es de 5 días.

Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello, el tallo de un moho que esté muy cargado de esporas dará recuentos en placa mucho más altos que otro de tamaño similar sin esporas.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

• Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de alimentos.

• Placas de Petri de vidrio (100x15mm) o de plástico (90x15 mm)

• Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml

• Baño de agua o estufa de aire forzado para templar el Agar fundido, 44-46°C

• Estufa de incubación a 29-31°C

• Contador de colonias (tipo Québec de campo oscuro o similar)

• Dispositivo de recuento automático

• Medio de Agar dextrosa y papa (PDA)

• Medio de Agar dextrosa y Sabouraud

PROCEDIMIENTO

1. Prepara las muestras de alimentos para su dilución, aplicando el método señalado en la práctica numero 4. Para hacer las diluciones pueden utilizarse los blancos de dilución o frascos de diluyentes sobrantes del método de recuento en placa. Es muy importante procurar que transcurra el menor tiempo posible entre la preparación de las diluciones y la siembra del inóculo, para evitar la multiplicación o muerte de los microorganismos suspendidos en el diluyente.

2. Pipetear en placas de Petri alícuotas de 1 ml de las diluciones 10-1. 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5, utilizando dos placas por cada dilución. Se propone este serie de diluciones para los casos e que no se conozca el número aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra. Las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre serán función del recuento esperado.

3. Rápidamente verter en las placas de Petri 10 a 15 ml de medio PDA o medio dextrosa Saboraud, fundido y templado a 44 –46°C.

4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el Agar balanceado la placa de izquierda a derecha cinco veces, rotándola en el sentido de las agujas del reloj otras cinco veces, realizando otras cinco veces el movimiento de vaivén en sentido perpendicular al primero y rotándola, finalmente, cinco veces en sentido contrario a las agujas del reloj.

5. Invertir las placas cuando se haya solidificado el Agar e incubarlas a 20 – 24°C durante3 –5 días.

6. Con ayuda del contador de colonias y el dispositivo de recuento con registro automático, contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 20 y 200, llevando a cabo un examen microscópico cuando sea necesario para identificar las colonias

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