RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

I.COMPETENCIAS

1. Identifica por reacciones de coloración específicas la presencia de monosacáridos, disacáridos y de polisacáridos

2. Reconoce cualitativamente la presencia de carbohidratos en muestras biológicas

3. Diferencia azúcares Hexosas de pentosas .

4. Diferencia e identificar azucares reductores y no reductores .

5. Diferencia azúcares aldosas de cetosas.

6. Valora el rol que desempeñan las reacciones de coloración en la determinación práctica de los carbohidratos

II. INTRODUCCIÓN

La composición química de los seres vivos es muy diferente a la de la materia inanimada, y aunque presenta diferencias muy significativas entre las distintas especies, también muestra muchas semejanzas en todos los organismos. Los elementos químicos presentes en los seres vivos (27) se denominan bioelementos, y se suelen clasificar en macroelementos (C, H, O y N), cada uno de los cuales aparece en una proporción superior al 5% del peso seco de la materia viva y en total constituyen aproximadamente el 90% de la biomasa; microelementos (Ca, P, K, S, Cl, Na y Mg), que varían entre el 0,3 y el 5% del peso seco y suponen casi el 10% de la biomasa; y oligoelementos o trazas (B, F, Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Mo, I, entre otros), que están presentes en cantidades muy pequeñas.

Estos bioelementos suelen formar parte de moléculas, denominadas biomoléculas, que pueden ser de naturaleza orgánica o inorgánica. Entre las inorgánicas están el agua, aniones (cloruros, fosfatos, carbonatos, etc.), cationes (sodio, potasio, calcio, amonio, etc.) y algunos gases como el O2 y el CO2. Entre las biomoléculas orgánicas destacan los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos, y sus correspondientes constituyentes básicos, y metabolitos como el piruvato, el 2-oxoglutarato, el malato, etc.

Para el reconocimiento de biomoléculas orgánicas, se utilizan diversas técnicas sencillas que pueden ser utilizadas para determinaciones cualitativas tanto como cuantitativas. El objetivo de la presente práctica es familiarizar con las reacciones específicas de coloración y a la identificación de Carbohidratos importantes.

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no.

La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu2+. El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la reacción pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solución ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solución para formar el hidróxido de cobre:

Cu + + OH - → Cu(OH) (precipitado amarillo)

El hidróxido pierde agua

2Cu(OH) → Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O

La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azúcar reductor.

Una secuencia que permite hacer el reconocimiento y diferenciación de carbohidratos se esquematiza a continuación:

Ensayo de Molisch: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural, los cuales reaccionan con α-naftol formando un color púrpura violeta.

Ensayo de Benedict: El ensayo de Benedict: permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Felhing, el de Benedict contiene ion cúprico en medio alcalino que se reduce hasta óxido cuproso en presencia de azúcares con el hidroxilo hemiacetálico libre.

Ensayo de Barfoed: Esta prueba permite diferenciar entre monosacáridos y disacáridos reductores, también contiene ion cúprico que se reduce hasta óxido cuproso más rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos.

Ensayo con Lugol: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azúl- violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja.

Ensayo de Seliwanoff: Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados.

Ensayo de Bial: El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.

III. MATERIAL Y METODOS

1. PRUEBA DE MOLISH:

El ácido sulfúrico concentrado hidroliza enlaces glicosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratado dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan luego con α - naftol originando un complejo púrpura. La reacción es la siguiente:

Ensayo de Molisch:

Soluciones patrón de carbohidratos : GALACTOSA, GLUCOSA, FRUCTOSA, MALTOSA LACTOSA (1%)

Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de la solución del carbohidrato y agregue 0.2 mL de α- naftol al 10%, mezcle bien y luego adicione CUIDADOSAMENTE POR LAS PAREDES DEL TUBO, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, la formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para carbohidratos.

2. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LA GLUCOSA (poder reductor de la glucosa)

2. 1 METODO DE FEHLING

a. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una disolución de glucosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Fheling, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo)

b. En otro tubo de prueba colocar 2 ml. del reactivo de Fehling y 0,5 ml de orina (u otro material), calentar 2 minutos a ebullición.

c. Si el material contiene glucosa, se reduce la sal de cobre y observar un precipitado de óxido cuproso de color rojo, anaranjado o amarillo

Fundamento de la reacción: En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4. Cuando el Cu(OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma óxido cuproso (de color rojo ladrillo). Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidación de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color.

2. 2 METODO DE BENEDICT

Soluciones patrón de carbohidratos: GLUCOSA, MALTOSA Y SACAROSA. Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de la solución del carbohidrato y agregue 0.1 mL del reactivo de Benedict, caliente al baño María. La formación de un precipitado amarillo o rojizo, es prueba positiva para carbohidratos reductores.

a. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una disolución de glucosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Benedict, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo)

b. En un tubo de prueba colocar 2 a 3 ml. del reactivo de Benedict y V a VII gotas de orina (u otro material), calentar a ebullición durante 2 minutos y dejar enfriar.

c. Si el material contiene glucosa, observar un precipitado rojo ladrillo, amarillo o verdoso, de acuerdo con la proporción en que se halla presente.

3. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LA FRUCTOSA

La fructosa aparece juntamente con la glucosa y da las mismas reacciones; para diferenciarlas puede emplearse la reacción de Seliwanoff. Esta se basa en la formación de un precipitado de color rojo cuando la levulosa se calienta en una solución fuertemente ácida de resorcina, por la formación de OXIMETILFURFUROL.

REACCION DE SELIWANOFF

La reacción se basa en la formulación del 5-hidroximetil furfural, mediante el calentamiento de la Fructosa con el acido. El 5-Hidroximetil furfural da con la resorcina (meta dihidroxibenceno) un producto de condensación de color rojo cereza.

Soluciones patrón de carbohidratos: FRUCTUOSA Y GLUCOSA.

Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de la solución del carbohidrato y agregue 2 mL del reactivo de Seliwanoff, caliente en baño María a ebullición por dos minutos. La formación de una coloración roja es prueba positiva para cetosas.

a. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una disolución de fructosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Seliwanoff, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo)

b. En un

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