La especialización en la estructura del ARN del virus del dengue facilita la adaptación del huésped

La especialización en la estructura del ARN del virus del dengue facilita la adaptación del huésped

Abstracto

Muchos patógenos virales entre humanos e insectos. Estos virus deben tener estrategias desarrolladas para la adaptación rápida a diferentes entornos de host. Sin embargo, la base mecanicista para el proceso de adaptación sigue siendo poco conocida. Para estudiar el ciclo de adaptación mosquito-humano, examinamos los cambios en las estructuras de ARN del genoma del virus del dengue durante la adaptación del huésped. La secuenciación profunda y el análisis de la estructura del ARN, junto con la evaluación de la aptitud, revelaron un proceso de especialización del huésped de elementos de ARN del 3'UTR viral. La adaptación a células de mosquitos o mamíferos implicó la selección de diferentes poblaciones virales que recolectaban mutaciones en una sola estructura de tallo-bucle. La especialización de host de la estructura de ARN identificada dio como resultado un costo significativo de aptitud viral en el host no especializado, lo que representa una limitación durante el cambio de anfitrión. El análisis de conservación de la secuencia indicó que la estructura del bucle del tallo adaptable del huésped se ha duplicado en el dengue y otros virus transmitidos por mosquitos. Curiosamente, los estudios funcionales que usan virus recombinantes con bucles de doble o único tallo revelaron que la duplicación de la estructura del ARN permite que el virus acomode mutaciones beneficiosas en un hospedador y nocivas en el otro. Nuestros hallazgos revelan nuevos conceptos en la adaptación de virus de ARN, en los que la especialización del huésped de las estructuras de ARN da como resultado una gran aptitud en el anfitrión adaptado, mientras que la duplicación de ARN confiere robustez durante el cambio de anfitrión.

Resumen del autor

Los patógenos virales importantes, como la gripe y el dengue, saltan entre especies; sin embargo, todavía no está claro cómo evolucionaron estos virus para una replicación eficiente en entornos significativamente diferentes. Usando el virus del dengue como modelo, que alterna naturalmente entre humanos y mosquitos, se investigaron los cambios en el ARN viral en cada huésped. El análisis de secuenciación profunda reveló la selección de poblaciones virales sorprendentemente diferentes durante la adaptación del huésped. Las mediciones de la condición física indicaron que las mutaciones en una única estructura de ARN de la región 3 'no traducida viral eran responsables de la selección positiva y negativa de variantes víricas específicas en los dos hospedadores. Se observaron ciclos de disrupción y reconstitución de esta estructura de ARN durante la conmutación del anfitrión, identificando un elemento de ARN adaptable al huésped. Es importante destacar que se encontró que la duplicación natural de este ARN era necesaria para tolerar mutaciones asociadas a mosquitos para una replicación eficiente en células de mamíferos. Nuestros estudios revelaron una nueva estrategia de adaptación viral, donde la especialización y duplicación de la estructura del ARN proporcionan un mecanismo para mantener una buena capacidad viral en cada huésped y la eficiencia durante el ciclismo del huésped. Debido a que la estructura de ARN identificada y su duplicación se conservan en muchos flavivirus transmitidos por mosquitos, nuestros hallazgos utilizando el virus del dengue podrían ayudar a comprender la evolución del ARN de un amplio grupo de patógenos humanos.

Introducción

Los arbovirus infectan a los huéspedes vertebrados e invertebrados. Este proceso natural de cruce entre especies plantea una serie de preguntas sobre la capacidad de estos virus para utilizar diferentes mecanismos celulares y superar diferentes tipos de respuestas antivirales. Los virus de ARN en general tienen una gran capacidad para adaptarse a diferentes entornos debido a la diversidad genética de las poblaciones virales [1, 2]. Una de las consecuencias de esta capacidad de adaptación es la aparición de nuevos virus patógenos [3]. Se ha supuesto que los virus que se alternan naturalmente entre diferentes hosts evolucionan con menos rapidez que aquellos que se especializan en un único huésped [4]. Esta restricción evolutiva se puede atribuir principalmente al ciclo obligatorio entre hosts con demandas conflictivas para la replicación viral, donde los cambios de secuencia que mejoran la aptitud en un host pueden no ser ventajosos o incluso pueden ser perjudiciales en el otro huésped [5]. Varios estudios que utilizan arbovirus respaldan la idea de que la liberación de un virus de la alternancia del huésped podría dar lugar a la especialización del huésped con un costo de aptitud física en el huésped anulado (para revisiones ver [6, 7]). Aunque se ha acumulado una gran cantidad de información sobre este tema utilizando sistemas tanto in vivo como in vitro, la comprensión de los aspectos moleculares de la especialización del huésped y los determinantes genéticos del costo de adecuación asociado con la alternancia del huésped sigue siendo un desafío importante. Usando el virus del dengue (DENV), un miembro de la familia Flaviviridae que cicla entre mosquitos y humanos, recientemente encontramos secuencias de ARN específicas en la 3'UTR viral que son esenciales para la replicación viral en células de mosquito pero prescindibles para la replicación en células de mamífero [8] ] Estos estudios proporcionaron evidencia directa de las funciones específicas del huésped de los elementos del ARN viral y plantearon la cuestión de si las estructuras de ARN viral están bajo presiones selectivas específicas durante la adaptación del hospedador.

El genoma de DENV es una molécula de ARN dinámica que adopta conformaciones lineales y circulares en la célula infectada. Este ARN contiene una gran cantidad de información en las estructuras de ARN de acción cis que mejoran, suprimen y / o promueven la replicación viral [9]. El 5'UTR viral incluye dos elementos esenciales para la replicación de DENV en células de mosquitos y mamíferos, el promotor para la síntesis de ARN conocido como stem-loop A, y una secuencia de ciclación del genoma [10]. La organización general de DENV 3'UTR es similar a la de otros flavivirus, que contienen elementos esenciales para la replicación viral y estructuras accesorias de ARN que modulan los procesos virales. Una característica interesante del 3'UTR de todos los flavivirus es la presencia de repeticiones directas cortas (DR) y duplicaciones largas del elemento RNA [11]. La función de estas duplicaciones aún no está clara, pero estudios evolutivos previos han sugerido la asociación directa de estos elementos de ARN con la adaptación viral a múltiples huéspedes de invertebrados y vertebrados [12].

DENV se está expandiendo geográficamente y está aumentando en virulencia, mientras que no hay disponibles vacunas ni antivirales específicos. En consecuencia, comprender los determinantes y las limitaciones de la alternancia entre humanos y mosquitos será importante para desarrollar medidas antivirales efectivas. Aquí, describimos cómo los elementos DENV RNA que actúan en cis evolucionan bajo presiones selectivas de un solo huésped en células de mosquitos y mamíferos. La secuenciación profunda de las poblaciones de DENV sometidas a la adaptación del huésped mostró una fuerte selección de mutaciones específicas en el 3'UTR vírico en cada huésped, mientras que los elementos que actúan en cis presentes en el extremo 5 'del genoma se mantuvieron sin cambios. El análisis de la estructura del ARN secundario mostró que los virus seleccionados en células de mosquito contenían mutaciones que mapeaban a una estructura de tallo único (SL). La aptitud de los virus recombinantes que portan las mutaciones identificadas mostró requisitos contradictorios para la replicación en células humanas y de mosquito. Se observaron ciclos de interrupciones y reconstituciones de la estructura SL identificada durante la conmutación del anfitrión, definiendo una estructura de ARN adaptable al anfitrión. Estos cambios de ARN observados durante la adaptación experimental recapitularon la selección de mutaciones observadas en aislados naturales de DENV de humanos y mosquitos. El análisis filogenético de las características estructurales de 3'UTRs de los flavivirus transmitidos por mosquitos (MBVF) reveló una duplicación conservada de la estructura SL adaptable al huésped, que está ausente en los flavivirus específicos de insectos. Curiosamente, al usar virus con SL únicas o duplicadas, encontramos que se requiere la duplicación de ARN para tolerar las mutaciones asociadas a los mosquitos para la replicación en células de mamíferos, donde estas mutaciones son nocivas. Sugerimos un modelo novedoso para la adaptación viral específica del hospedador donde la especialización y duplicación del ARN proporciona un mecanismo para mantener una alta aptitud viral en cada huésped y una robustez durante el ciclo del vector-huésped.

Resultados

Dinámica de las poblaciones de DENV durante la adaptación de la célula huésped

Para explorar la adaptación específica del huésped de las estructuras de ARN en el genoma de DENV, se examinaron las variaciones de la secuencia de nucleótidos en poblaciones de DENV restringidas para replicarse en células de mosquitos o mamíferos durante 20 pases consecutivos. Las poblaciones virales se obtuvieron por transfección de un ARN transcrito in vitro del clon de ADNc DENV2 infeccioso pD2-IC 30-PA [13], originalmente aislado de un paciente con fiebre hemorrágica del dengue (genotipo asiático). Las primeras poblaciones virales obtenidas en mosquito C6 / 36 y células BHK de mamíferos se denominaron pasaje 1 (P1). El virus P1 de cada tipo de célula se pasó en serie para generar P5, P10, P15 y P20 en la misma línea celular. Dos experimentos de adaptación independientes se realizaron simultáneamente. Se obtuvieron amplicones correspondientes al extremo 5 'genético y 3'UTR de cada población y se usaron para la secuenciación profunda. Los datos de secuencia en bruto se procesaron siguiendo un flujo de trabajo descrito en Procedimientos experimentales. Las variantes virales en la población se definieron usando enfoques estadísticos y de agrupamiento. Un grupo de secuencias se consideró una variante diferente cuando su frecuencia en la población era del 1% o superior.

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