DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN PROTEICA POR ESPECTROFOTOMETRÍA

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DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN PROTEICA POR ESPECTROFOTOMETRÍA

REPORTE DE PRACTICA.

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PRACTICA No. 4

1. INTRODUCCIÓN

Proteínas.

Son las máquinas moleculares que permiten que ocurran complejos procesos celulares como la respiración, la síntesis de ADN y la movilidad. Mientras que todas las proteínas están ensambladas a partir del mismo grupo de 20 aminoácidos, su longitud y secuencia determinan su actividad y estructura. Las células en crecimiento activo pueden contener más de 2000 diferentes proteínas, las que varían en sus concentraciones individuales. En la mayoría de las células bacterianas y animales, las proteínas comprenden una pequeña proporción de la masa celular por la presencia de otros polisacáridos en las membranas celulares.

Aminoácidos.

Todos los aminoácidos están basados en una estructura común, en la que un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH), un hidrógeno (-H), y una cadena lateral, o grupo R están unidos a un átomo de carbono central.

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Péptidos y Proteínas.

Los aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos para formar pequeños péptidos y proteínas más largas a través de un proceso de síntesis de condensación o deshidratación. Un enlace peptídico se crea al remover los componentes de una molécula de agua del grupo de ácido carboxílico de un aminoácido y del grupo amino del siguiente aminoácido en la cadena. Debido a que todos los aminoácidos tienen un grupo amino y un grupo ácido carboxílico, pueden unirse entre ellos en cualquier orden. El grupo R o cadena lateral simplemente se extiende hacia afuera de la columna vertebral de la cadena de aminoácidos. La cadena de polipéptido se extiende desde el primer aminoácido, que tiene un grupo amino libre, hasta el último aminoácido, que tiene un grupo ácido carboxílico libre.

Una proteína puede ser descrita en términos de su secuencia de aminoácidos; sin embargo las proteínas en una célula viviente no existen como cadenas lineales simples. En lugar de eso, cada cadena se encuentra doblada a través de enlaces químicos débiles entre los enlaces peptídicos y los grupos R en complejas conformaciones tridimensionales.

Curvas Standard.

Cuando no se está seguro de la linealidad de la relación entre la concentración y la absorbancia, se puede usar espectrofotometría para realizar una medición cuantitativa, si primero se construye una curva standard.

Una vez que la curva standard ha sido creada, puede usarse para determinar la cantidad del compuesto de interés en una solución desconocida. Se puede emplear la ecuación de la recta en la región lineal de la curva standard para crear un factor de conversión para relacionar la absorbancia y la cantidad. En la región lineal la ecuación de la recta tiene la forma:

y = mx + b

Dónde “m” es la pendiente de la línea y “b” es el intercepto en el eje Y. Si b = 0 la línea cruza el origen en el punto 0,0, y se puede usar entonces la pendiente de la línea como el factor de conversión debido a que da la relación directa entre x y y.

Ensayos Espectrofotométricos para Proteínas.

Existen cuatro ensayos espectrofotométricos que se usan comúnmente para ensayos para proteínas. Uno de ellos involucra medir la absorbancia a 545 nm después de la reacción de las proteínas con el Reactivo Biuret. Ésta reacción involucra la unión de un colorante a la cadena proteica.

Cualquier proteína puede ser usada para construir una curva standard, pero la más comúnmente usada es la proteína albúmina del suero bovino (bovine serum albumin; BSA), la cual se encuentra en el suero de vacas. La BSA se usa normalmente para transportar ácidos grasos a través de la sangre y se puede encontrar disponible de manera comercial a un relativo bajo costo. Se debe notar que el uso de una curva standard basada en una proteína particular es solo por conveniencia. El hecho de que una solución particular tenga una concentración proteica de 2.58 mg/ml solo indica que la solución contiene una cantidad proteica “aparente” que equivale a 2.58 mg/ml de la proteína BSA en solución.

Aunque la zona lineal de la curva standard parezca ser verdaderamente lineal, en realidad no se tiene forma de saber si esa “linealidad” continúa indefinidamente. De hecho, la mayoría de las curvas standard se alejan de la linealidad a valores de absorbancia altos debidos a altas concentraciones de proteína.

1. OBJETIVO

Determinar el contenido de proteína total en alimento de origen vegetal o animal

1. MATERIAL Y REACTIVOS

Material

Productos alimenticios líquidos o en polvo que tengan un contenido proteico significativo. Asegúrese que en la etiqueta de contenido nutricional (en el lateral del envase) indique la porción recomendada y el número de gramos de proteína por porción. Ejemplos de estos alimentos pueden ser productos como el Ensure o Soy Milk que tienen un bajo contenido de grasas; alternativamente se pueden usar productos de proteína en polvo como el Slimfast Shake Mix o Carnation Instant Breakfast Mix (UNO POR EQUIPO)

Balanzas, espátulas y platillos plásticos para pesado

Vaso de precipitados 250 ml

Barra magnética para agitación y parrilla de agitación

Probeta 100 ml

2 Matraz Erlen-Meyer 250 ml

Espectrofotómetro y cuvettes (celdillas)

Tubos de ensaye de 13 x 100 mm y de 1.5 ml

Micropipetas (de los tres volúmenes) y puntas para pipeta

Kim-Wipes

Parafilm

Vortex

Reactivos

Buffer de Fosfato de Potasio 0.1 M pH 7.0

Solución stock de albúmina de suero bovina (bovine serum albumin, BSA) 1.0 mg/ml

Reactivo de Biuret

1. METODOLOGÍA

Ésta práctica tiene varias partes pero pueden realizarse secuencialmente.

Preparación del Extracto Alimenticio.

1. Observe de cerca y atentamente la etiqueta de contenido nutrimental; registre la porción sugerida y el número de gramos de proteína por porción
2. Abra el paquete y mida una porción sugerida. Dependiendo del producto, puede referirse a cierto peso en gramos u onzas (recuérdese 1.0 g = 0.0353 onzas) o a cierto volumen en litros o tazas (una taza en onzas = 250 ml). Si parece que es mucha cantidad de material, emplee solo un cuarto o un octavo de la porción sugerida. Considere que el volumen total de líquido que se adicionará es 100 ml
3. Transfiera el material al matraz
4. Adicione 100 ml de buffer de fosfato de potasio 0.1 M a pH 7.0 al material alimenticio
5. Agite el material por dos minutos o hasta que no queden grumos si se está usando polvo proteico
6. Decante la suspensión en una probeta y mida el volumen en mililitros
7. Transfiera la suspensión a un matraz limpio y almacénela para el ensayo proteico más adelante. Este es el extracto proteico.

Incluya aquí la siguiente información de la fuente alimenticia:

¿Cuál fue la fuente alimenticia que empleaste?

Leche en polvo de soya.

¿Cuál era la porción recomendada? ¿Qué parte de la porción recomendada empleaste?

Porción recomendada: 100g, Porción usada: 10g.

¿Cuál es el contenido de proteína en gramos/porción?

26g

¿Cuántos ml del extracto obtienes después de homogeneizar una parte de la porción recomendada?. Si se usó menos de la porción recomendada también se debe registrar

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