DISTRIBUCIÓN DEL VIRUS DE LA LENGUA AZUL EN TEJIDOS DE OVEJAS INFECTADAS DE MANERA NATURAL/BLUETONGUE VIRUS DISTRIBUTION IN TISSUES FROM NATURALLY INFECTED SHEEP

La lengua azul (LA) es una enfermedad causada por un virus ARN bicatenario sin envuelta y de simetría icosaédrica perteneciente el género Orbivirus. Este virus afecta a óvidos, bóvidos y otros rumiantes como pueden ser los cérvidos y se transmite por insectos del género Culicoides. Algunos de los síntomas que produce son edema, coronitis que da lugar a cojera, úlceras en mucosas y encías y cianosis de la lengua, lo que le da el nombre debido a la tonalidad azulada de la misma. Es una enfermedad que da lugar a grandes pérdidas económicas.

Se conocen 24 serotipos de LA, cuya distribución ha aumentado en los último diez años hasta superar el paralelo 40° N (límite norte de la distribución de la enfermedad hasta 2006), llegando en la actualidad a afectar países europeos que se encuentran a latitud 60° N. Los serotipos 1, 2, 4 y 8 han producido pérdidas económicas en España desde el año 2000. En el resto de Europa circulan, además, los serotipos 8, 9 y 16.

Las secuencias génicas que codifican proteínas víricas, tanto estructurales como no estructurales, se utilizan como diana para detectar la presencia del virus. Entre ellas, cabe destacar las proteínas VP2 y NS1. La primera forma parte de la capa externa del virus y presenta gran variabilidad entre los serotipos, por lo que se usa para una detección seroespecífica. La segunda es no estructural y su secuencia genética está muy conservada en distintos serotipos, por lo que sirve para la detección genérica del virus.

El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la distribución del virus en distintos tejidos de ovejas infectadas de manera natural, utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa (RT-PCR) para poder detectar el virus.

Material y métodos

* Animales: Se obtuvieron muestras de tejidos provenientes de dos ovejas con síntomas evidentes de LA (cojera, edema facial, descarga nasal y ulceración en las encías). Tras la eutanasia con sobredosis de pentobarbital sódico se obtuvieron muestras de bazo, arteria pulmonar, sangre y suero. Por cada oveja, se han analizado cinco muestras distintas procedentes de cada tipo de tejido.

Extraccion de ARN: se parte de 100Êl de sangre, suero y del homogeneizado de los tejidos. Se uso el reactivo Trizol (Invitrogen). El protocolo realizado se describe en (Chomczynski et al., 1987). Brevemente, el proceso consta de separar todos los componentes lipídicos de cada muestra, de la fase soluble en agua, donde se encuentra el ARN. Después se realiza una precipitación del ARN con etanol y la muestra se resuspende en agua libre de RNAsas.

* RT-PCR: Se amplificó el fragmento de ARN que codifica las proteínas VP2 y NS1 usando cebadores genéricos del virus de LA (Figura 1) y específicos del serotipo 1 (Figura 2)

La reacción de RT-PCR consta de 40 ciclos en los que se repiten tres pasos precedidos del paso de retrotranscriptasa, en el que esta enzima realiza copias de ADN a partir de ARN a 48°C. Los tres pasos de la PCR constan de: un paso a 95°C para la desnaturalización de las hebras, un paso a 52°C para la unión de los cebadores y un paso a 72°C para que la polimerasa transcriba dando lugar a más copias. Se obtienen mas de dos billones de copias del fragmento que queremos amplificar.

* Controles: Como control positivo se utilizó una muestra de ARN del virus de LA del serotipo 1 obtenida por infección de un cultivo celular de células de riñón de mono verde. Como control negativo se utilizó una muestra de ARN del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) y tres muestras en las que se utilizó agua destilada para realizar el proceso de extracción de ARN.

* Electroforesis: gel de agarosa al 2% teñido con colorante SYBR-GREEN, que se une a ácidos nucleicos de cadena doble, para visualizar los productos de la RTPCR. Se usa un marcador de pesos moleculares como referencia, en el que cada banda se corresponde con cien pares de bases. Esta técnica se basa en la carga parcial negativa de la muestra que le permite el desplazamiento por el gel según su tamaño. En la RT-PCR genérica el fragmento es de 274 pares de bases y en la específica del serotipo 1 es de 765 pares de bases (Figura 3).

Resultados

Tras el análisis de cinco muestras de suero, sangre, bazo y arteria pulmonar procedentes de dos ovejas

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