Microbiologia

Colorantes.

Son compuestos orgánicos que tienen afinidad específica por las cargas eléctricas de materiales celulares. Estas son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Tipos de tinción

Tinción simple. Es una solución acuosa o alcohólica básica de un colorante único. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma específica a los distintos partes de la célula, el propósito principal de una tinción simple es destacar el microoganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se aplica durante un tiempo determinado y luego se lava a continuación el portaobjetos se seca y se examina. En ocasiones se agrega una sustancia química a la solución para intensificar la coloración, este aditivo se denomina mordiente. Una de las funciones de un mordiente es aumentar la afinidad de una muestra biológica por un colorante. Otra es cubrir alguna estructura como flagelos, para darle mayor espesor y facilidad de observación después del teñido. Algunas de las tinciones simples utilizadas con frecuencia son con el azul de metileno, carbolfuccina, violeta de genciana y la saframina.

Tinción diferencial. A diferencia de las tinciones simples, las diferenciales reaccionan de manera diferentes con las distintas clases de bacterias, y por lo tanto pueden ser empleadas para establecer una distinción entre ellas. las tinciones utilizadas con más frecuencia son la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol-resistencia.

La tinción de Gram

Procedimiento. Si bien, hay modificaciones de la tinción Gram clásica que implican cambios en los reactivos y en los tiempos, lo principios y resultados son iguales para todas las modificaciones. El procedimiento básico de la tinción Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol. Los portaobjetos se cubren con metanol al 95% durante un minuto, se deja escurrir el metanol y el portaobjetos se seca antes de la tinción. Después de la fijación el primer paso en la tinción. Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante principal Cristal Violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram, para que el colorante alcalino se una a la pared

celular de las bacterias a través de los enlaces químicos. La decoloración distingue a las células G+ de las G-. Después de la decoloración los microorganismos que aparecen como G+ retienen el cristal violeta y los G- lo pierden. el agregado de colorante de contraste safranina teñirá el color rosa o rojo a las bacterias G- claras.

Principio. las diferencias en la composición el las paredes de las células G+, que contienen una capa gruesa de péptido glucano con numerosos enlaces cruzados de ácido teicoico, y las paredes de las células G- en las que la capa de péptidoglucano es mas delgada, se explican las diferencias de estas dos principales bacterias. Es probable que la cantidad de enlaces cruzados del ácido tecoico de las bacterias G+ contribuya a la capacidad de resistir la decoloración con alcohol. Si bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos G+, su color violeta no se altera. Los microorganismos que perdieron su pared celular a causa de los antibióticos permiten que el violeta cristal se elimine y puedan ser estar, Gram variables con algunas células coloreadas de rosa o de violeta, sin embargo estos microorganismos se consideran G*+ verdaderos. Por otra parte las bacterias G- raras veces retienen el cristal violeta si el procedimiento se ha ejecutado de la manera adecuada.

Observación de la tinción Gram. Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión 100x. Cuando el material orgánico se tiñe con Gram, el portaobjetos se evalúa en busca de células bacterianas así como de las reacciones de Gram, la morfología (cocos, bacilos, etc), la disposición (cadenas, pares, racimos, etc.) de las células observadas. en los frotis directos también debe buscarse la presencia de células infamatorias que representan indicios de alguna infección. También es útil buscar otro tipo de células huésped como las epiteliales

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